miR-26a對腦梗死大鼠血管生成的調節作用及其機制

職 瑾,段 斌,王 靜,王 清,王虎清

(1西安市第一醫院神經內科,西安 710002;2陜西省人民醫院腎病血透中心;3西安交通大學第二附屬醫院神經內科;*通訊作者,E-mail:Zhijin7911@163.com)

腦梗死是一種高發病率、高殘疾率和高死亡率的疾病,嚴重危害人類健康[1]。研究數據顯示,超過90%的腦梗死患者發作后4.5 h內未進行治療,就無法從早期溶栓治療中受益[2]。急性腦梗死患者中只有2.4%接受了溶栓治療,其中只有1.6%接受了重組組織纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA)的治療[3]。其治療的基本原理是梗死后側支通道的重建,重建主要取決于血管生成。也有報道稱,腦梗死后血管密度與患者的預后有關。因此,研究腦梗死后血管新生的潛在機制,尋找更有效的防治方法具有重要意義[4]。

微小RNA(microRNA,miRNA)是近年發現的一類約20-25個核苷酸大小,具有轉錄后調節活性的內源性非編碼單鏈小分子RNA,通過與靴基因完全或不完全匹配,直接降解靶基因或抑制靶基因翻譯[5]。研究發現,microRNA可調節的基因占人類基因組的1/3以上,參與調控多種信號轉導途徑包括細胞增殖、分化、凋亡、死亡、免疫調節等多種生命活動,從而與人類多種疾病密切相關已逐漸成為醫學領域的研究熱點。既往血管再生相關研究[6]著重針對其主要觸發因素如血管剪切力改變、缺氧等,近年來有關miRNA調控組織缺血后血管新生的研究逐漸增多,相繼發現了一系列與血管生成有關的miRNA,按其生物功能可分為促進血管生成的miRNA[7]和抑制血管生成的miRNA[8]。這些實驗成果在體外培育的內皮細胞和或腫瘤、肢體缺血、腎缺血再灌注、缺血性心肌病等動物模型體內得到了相關證實。而近兩年開始出現腦缺血后血管新生的相關的研究,有學者提出是腦缺血后血管再生的正調控因子。研究發現[9],miR-296促進大鼠腦缺血梗死后血管新生的過程,通過抑制其靶基因HGS的表達,上調VEGF-VEGFR2信號通路的活性,促進血管新生的過程。

microRNAs參與和調控多種生物學過程[10],據報道,許多microRNA在缺血組織中的表達模式發生了巨大變化[5];然而,在梗死誘導的血管生成中僅研究了少數miRNA功能[11],這使得本實驗有必要探索和闡明microRNA-26a(miRNA-26a)在腦梗死中的作用及其對調節腦梗死大鼠血管生成的機制。因此,本研究使用MCAO大鼠模型和體外氧葡萄糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)模型來研究miRNA-26a在大鼠腦梗死中的作用。旨在通過miRNA-26a過表達及其抑制來研究miRNA-26a對血管生成的影響,為臨床治療缺血性腦梗死和血管修復新靶標的確定提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

16只SPF級Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠(250-300 g)由西安交通大學醫學部醫學實驗動物中心(SYXK(陜)2018-001)提供,大鼠的周齡和體質量差異無統計學意義(P>0.05)。大鼠飼養于西安交通大學醫學部醫學實驗動物中心專用飼養室,釆用架式籠養,光照12 h明暗交替,保持飼養穩定為20 ℃左右,濕度為50%-60%,對動物的處理嚴格遵循《實驗動物管理條例》。Ⅱ型膠原酶(Thermo Fisher Scientific),DMEM(Thermo Fisher Scientific,USA),FBS(Gibco,Rockville,USA),TTC(Sigma-Aldrich),RNA提取試劑盒(Invitrogen,USA),RIPA(Roche,Basel,Switzerland),抗VEGF、抗FGF、抗Ang和山羊抗兔IgG抗體(Cell Signaling,Danvers,MA,USA),VEGF抑制劑Sorafenib Tosylate(Selleck Chemicals,USA)大鼠腦微血管內皮細胞(廣州吉妮歐生物科技有限公司,JNO17-733)。

1.2 動物模型建立

將16只SPF級雄性SD大鼠隨機分為2組,每組8只:假手術組和腦梗死模型組。根據改良的Longa方法建立腦中動脈閉塞(MCAO)大鼠模型[12]。實驗組大鼠給予16%水合氯醛以350 mg/kg劑量行腹腔注射麻醉后,仰臥固定于木板上,接著分離頸內、頸外動脈并結扎。假手術組用相同的手術步驟進行但不結扎。所有大鼠術后放置于溫暖適宜的環境中,直到從麻醉中蘇醒,并在手術后24 h處死大鼠收集樣品用于大鼠腦梗死體積檢測和miR-26a表達水平的檢測。

1.3 細胞體外培養和轉染和分組

大鼠腦微血管內皮細胞(BMEC)經胰酶消化且傳代達80%融合時,將第4或5代細胞用于實驗。將正常BMEC細胞分為正常組、miR-26a mimic組、miR-26a inhibitor組、miR-26a mimic+VEGF inhibitor組和氧葡萄糖剝奪(OGD)模型組。對照組采用正常大鼠腦微血管內皮細胞作為對照;miR-26a mimic組BMEC細胞轉染miRNA-26a模擬物;miR-26a inhibitor組BMEC細胞轉染miRNA-26a抑制劑;mimic+VEGF inhibitor組BMEC細胞轉染miRNA-26a模擬物和添加VEGF抑制劑Sorafenib Tosylate(50 mmol/L);OGD組將培養箱氧氣濃度調至1%,并將培養基換為不含葡萄糖的Earle’s平衡鹽溶液,分別缺氧缺糖10 h后取出細胞,恢復正常條件繼續培養24 h后倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化,構建體外氧葡萄糖剝奪細胞模型。

1.4 腦梗死體積檢測

大鼠處死后收集大腦組織,然后進行梗死體積檢測;從額葉開始將大腦切成2 mm的冠狀切片,并在2% 2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)中孵育37 min,然后在4%多聚甲醛中固定過夜,用計算機圖像分析儀定量梗死體積。

1.5 神經功能評估

按照Garcia等[13]的方法對每只大鼠的神經功能進行評估,本實驗中大鼠神經系統缺損按3-18的等級進行評估(3分為最大缺陷評分;18分為正常評分),其中評分越低則代表損傷嚴重程度越高。

1.6 RNA提取和實時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)

使用Trizol法RNA提取試劑盒提取大鼠腦組織和體外培養大鼠腦微血管內皮細胞的總RNA,逆轉錄合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)。通過實時定量PCR檢測基因表達水平,其引物序列如下。MiR-26a F:5′-TCCGTTGTTTCAAGTAATCCAGG-3′;R:5′-ATCAACCACACGTCATGTGACT-3′;GAPDH F:5′-CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3′;R:5′-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3′。

1.7 MTT法檢測細胞增殖

取胰蛋白酶消化后轉染的大鼠腦微血管內皮細胞,并將其接種于96孔板(5×103/孔)中,每組重復3次。向每孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),然后將細胞在37 ℃下孵育2 h。用酶標儀測定450 nm處的吸光度,實驗重復3次。

1.8 倒置顯微鏡觀察血管內皮細胞小管形成情況

取胰蛋白酶消化后轉染的大鼠腦微血管內皮細胞,接種到備好的6孔培養板內用含10%胎牛血清的M199培養,顯微鏡下見細胞成團塊狀生長,待細胞團長到適當密度時吸入無菌離心管,500 r/min離心5 min。將纖維蛋白膠、M199、NaOH和HEPS(8 ∶1 ∶0.5 ∶0.5)加入上述離心試管內,用吸管吹打混勻,在24孔板內加入混有細胞團的纖維蛋白膠,37 ℃孵育30 min,利用功能倒置相差顯微鏡觀察并記錄鼠血管內皮細胞小管形成和細胞增殖情況。

1.9 TUNEL染色檢測BMEC細胞凋亡

將大鼠腦微血管內皮細胞用二甲苯脫蠟(5 min,3次),并用100%乙醇、95%乙醇和70%乙醇梯度脫水3次。然后與蛋白激酶K孵育30 min,并用PBS洗滌。然后將切片與末端脫氧核苷酸轉移酶和熒光素酶標記的dUTP在37 ℃下反應1 h。加入辣根過氧化物酶標記的特異性抗體,再在37 ℃的培養箱中培養1 h。用DAPI對細胞核染色后,對切片進行拍攝并在熒光顯微鏡下計數。

1.10 VEGF、FGF和Ang蛋白質免疫印跡分析

通過放射免疫沉淀測定法(RIPA)裂解物提取BMEC細胞中總蛋白。將所有蛋白質樣品定量至相同濃度,保存在-80 ℃的冰箱中備用。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)用于分離細胞中提取的總蛋白,并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,再將膜與以下主要一抗在4 ℃孵育過夜,VEGF、FGF和Ang按1 ∶1 000比例稀釋。在Tris緩沖鹽水和Tween(TBS-T)中洗滌3次后,將膜與辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG抗體按1 ∶5 000稀釋溫育(室溫2 h);通過增強化學發光(ECL)成像的成像分析系統(Beyotime)確定蛋白條帶并計算灰度值。最后計算蛋白質表達水平,用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作內參對照,每組實驗均重復5次。

1.11 數據處理與統計分析

2 結果

2.1 大鼠腦梗死體積、腦神經功能和miR-26a的表達

與假手術組相比,模型組大鼠的腦梗死體積顯著增加(P<0.01),腦神經功能損傷評分顯著降低(P<0.01)。該結果說明大鼠腦梗死模型建立成功,可用于后續實驗研究。與假手術組相比,模型組大鼠腦組織中miR-26a的表達水平顯著上調(P<0.01)。體外細胞培養條件下,與正常組相比,OGD組中miR-26a的表達水平顯著上調(P<0.01,見圖1)。

與假手術組比較,**P<0.01;與正常組比較，##P<0.01圖1 腦梗死大鼠梗死體積和腦神經功能評估及miR-26a mRNA的表達Figure 1 Rat cerebral infarction volume, brain nerve function assessment and the expression of miR-26a mRNA in cerebral infarction rats

2.2 腦微血管內皮細胞中miR-26a的表達和細胞凋亡

與正常組相比,miR-26a mimic組中miR-26a的表達量顯著上調(P<0.01),而miR-26a inhibitor組中的表達量無顯著變化(P>0.05)。細胞凋亡檢測結果顯示,與正常組相比,miR-26a mimic組中腦微血管內皮細胞凋亡率顯著降低(P<0.01);與miR-26a mimic組相比,miR-26a inhibitor組中細胞凋亡率顯著升高(P<0.01),且與正常組相比無顯著差異(P>0.05,見圖2)。該結果提示miR-26a可能會抑制大鼠腦微血管內皮細胞的凋亡。

與正常組比較,**P<0.01;與miR-26a mimic組比較,##P<0.01圖2 腦微血管內皮細胞中miR-26a表達量變化和細胞凋亡情況 (×200)Figure 2 Expression of miR-26a and apoptosis in brain microvascular endothelial cells

2.3 miR-26a對血管內皮細胞小管形成和細胞增殖的影響

與正常組相比,miR-26a mimic組小管的形成和長度以及細胞增殖率均顯著增加(P<0.01);與miR-26a mimic組相比,miR-26a inhibitor組中小管的形成和長度以及細胞增殖率均顯著降低(P<0.01,見圖3)。該結果表明miR-26a可能對大鼠血管內皮的形成具有調控作用。

與正常組比較,**P<0.01;與miR-26a mimic組比較,##P<0.01圖3 miR-26a對血管內皮細胞小管形成和腦微血管內皮細胞增殖的影響 (×200)Figure 3 The effect of miR-26a on vascular endothelial cell tubule formation and brain microvascular endothelial cell proliferation (×200)

2.4 miR-26a對血管內皮相關因子蛋白表達的影響

與正常組相比,miR-26a mimic組中VEGF、FGF和Ang蛋白的表達水平均顯著上調(P<0.01);與miR-26a mimic組相比,miR-26a inhibitor組中VEGF、FGF和Ang蛋白的表達水平顯著下調(P<0.01,見圖4)。該結果表明miR-26a可能對大鼠血管內皮形成相關的因子或途徑具有調節作用。

與正常組比較,**P<0.01;與miR-26a mimic組比較,##P<0.01圖4 miR-26a對血管內皮相關因子VEGF、FGF和Ang蛋白表達量的影響Figure 4 The effect of miR-26a on the expression of vascular endothelial-related factors VEGF, FGF and Ang protein

2.5 VEGF抑制劑對血管內皮細胞小管形成和細胞增殖的影響

VEGF抑制劑Sorafenib Tosylate對miR-26a過表達細胞血管內皮細胞小管的形成及細胞增殖的影響結果顯示,與正常組相比,miR-26a mimic組中小管的長度顯著增加(P<0.01);與miR-26a mimic組相比,mimic+VEGF inhibitor組中小管的形成受到顯著抑制(P<0.01),mimic+VEGF inhibitor組中細胞的相對數目顯著減少(P<0.01,見圖5)。該結果表明miR-26a可能是通過調節VEGF來影響大鼠血管內皮功能和細胞的增殖。

與正常組比較,**P<0.01;與miR-26a mimic組比較,##P<0.01圖5 VEGF抑制劑對血管內皮細胞小管形成和腦微血管內皮細胞增殖的影響 (×200)Figure 5 The effect of VEGF inhibitor on vascular endothelial cell tubule formation and brain microvascular endothelial cell proliferation (×200)

3 討論

腦缺血性梗死是一種嚴重危害人類健康的疾病[14]。目前,促進梗死區域的血運重建是該疾病臨床治療的主要方法。因此,尋找有效治療方法,以促進缺血區域的血管生成、增加毛細血管數量和改善血液循環至關重要[15]。研究表明,miRNA-26a參與許多腫瘤的形成和發展,其可通過IL-6-Stat3信號通路抑制原發性肝癌的生長和轉移[16]。劉琦等[17]證明了miRNA-26a可能參與腫瘤相關的血管生成和細胞周期的調控。但是關于miRNA-26a對腦梗死大鼠血管生成的機制研究較少,因此,本研究著重于研究其對大鼠腦梗死和血管重建作用的調控機制,為腦梗死治療的靶點研究提供實驗依據。本實驗研究結果顯示,腦梗死損傷可促進miRNA-26a的表達,且miRNA-26a促進了腦微血管內皮細胞管腔的形成和細胞增殖,這表明miRNA-26a可能促進了大鼠腦梗死后腦微血管內皮細胞血管的生成。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)在機體內的主要功能是促血管生成[18]。而成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)被證實也與血管新生有關[19],其廣泛分布于人體組織以及相應的器官中,因組織配體的不同,而其自身的作用也不相同,主要包括促進血管新生、腫瘤形成、組織修復及代謝。血管生成素(angiogenin,Ang)是一種新型的參與血管生成的調節蛋白[20],主要維持血管內皮的穩定,并參與血管及肌肉纖維化進程[21]。主要由4種氨基酸組成,即Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4,其中Ang-1和Ang-2的細胞膜受體均為Tie-2,其受體屬于VEGF家族[22],高水平Ang會導致動脈粥樣硬化的迅速和嚴重發展。本研究結果也發現miRNA-26a可通過調節VEGF、FGF和Ang蛋白的表達,從而調節大鼠腦梗死后腦微血管內皮細胞血管的生成。血清VEGF、FGF和Ang與急性腦梗死患者頸動脈狹窄相關,且VEGF、FGF和Ang水平的升高可能會增加急性腦梗死患者頸動脈顱外段狹窄出現的風險[23]。FGF水平較高的患者心血管風險增加[24],FGF的高水平也會使得缺血性腦血管病發病率明顯增高[25,26]。本結果也與前人的研究結果相一致,我們也發現miRNA-26a可通過調節VEGF、FGF和Ang蛋白的表達,從而調節大鼠腦梗死后腦微血管內皮細胞血管的生成。且進一步的研究表明,抑制或下調VEGF的表達可以逆轉腦微血管內皮細胞中miRNA-26a對血管內皮管腔的形成和細胞增殖的促進作用。這一結果證明了miRNA-26a可能通過調節VEGF的表達來影響腦梗死大鼠血管內皮功能及血管的重建。

綜上所述,miRNA-26a通過調節血管內皮相關因子(VEGF、FGF和Ang蛋白)的表達影響腦梗死大鼠血管內皮功能及血管的重建和細胞的增殖,從而調節大鼠腦梗死后腦微血管內皮細胞血管的生成。本研究結果可能為腦梗死治療提供新的見解和參考,以期成為腦梗死治療的生物靶標之一。