蘆丁對(duì)高脂高糖飲食造成的小鼠腦損傷的保護(hù)作用

周勇兵,馬新壯,余麗麗,湯雨婷,王 力*

(1蚌埠醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室,蚌埠 233030;2慢性疾病免疫學(xué)基礎(chǔ)與臨床安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:wangli@bbmc.edu.cn)

當(dāng)代社會(huì),由飲食誘導(dǎo)肥胖引起的各種健康問(wèn)題備受關(guān)注。單純性肥胖(obesity)是由多因素引起的體內(nèi)脂肪積累過(guò)多而影響人類健康的慢性流行性疾病。它是一種涉及遺傳、代謝、激素和行為成分的慢性疾病[1]。肥胖的發(fā)生會(huì)引起多種代謝并發(fā)癥,導(dǎo)致人體內(nèi)各臟器不同程度氧化損傷,除了內(nèi)源性防御外,減少氧化還原的均衡飲食在預(yù)防由氧化損傷所導(dǎo)致疾病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2]。肥胖導(dǎo)致的臟器氧化損傷日益積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞功能損害。為了淬滅自由基或減少氧化產(chǎn)物,研究者不斷尋找天然高效的化學(xué)成分等天然抗氧化物質(zhì)。希望這類天然抗氧化物質(zhì)能在控制肥胖以及抵抗因肥胖而產(chǎn)生的危害上發(fā)揮重要作用。黃酮類物質(zhì)是一類多酚類化合物,其具有平喘、抗氧化、抗炎等多重生物學(xué)活性[3],蘆丁(rutin)作為黃酮類物質(zhì)典型代表,廣泛存在于桑葚、葡萄、茶葉、蔬菜等植物中,具有多種生理藥理活性[4],可預(yù)防和治療由高脂飲食引起肥胖所導(dǎo)致的多種代謝性疾病,Choi等[5]研究發(fā)現(xiàn)蘆丁具有抑制脂肪前體細(xì)胞形成的作用,Hamit等[6]研究發(fā)現(xiàn)蘆丁對(duì)大鼠大腦組織中因大腸菌素誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。因此,本研究通過(guò)建立蘆丁干預(yù)高糖或高脂飲食誘導(dǎo)ICR雄性小鼠營(yíng)養(yǎng)肥胖模型,來(lái)探索蘆丁在小鼠腦脂質(zhì)氧化損傷中所起的抗氧化作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

蘆丁(純度≥98%,C27H30O16,百靈威),4%多聚甲醛(塞維爾生物科技公司),甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所),其他化學(xué)試劑均為分析純。KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新公司),DY89-Ι型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝有限公司),Synergy2型酶標(biāo)儀(Biotek,美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR雄性小鼠40只,購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng),動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(滬)2013-0006,體質(zhì)量22-24 g。各組小鼠在12 h/12 h晝夜交替循環(huán)時(shí)間,20-25 ℃室溫和50%-60%濕度的標(biāo)準(zhǔn)條件下喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)處理及過(guò)程經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批(倫動(dòng)科批字[2018]第006號(hào)),符合動(dòng)物倫理要求。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)及方法

1.3.1 分組和構(gòu)建模型 顆粒狀嚙齒動(dòng)物飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)均等分為:正常組,喂養(yǎng)普通飼料(小麥19%,玉米38%,麩皮14%,豆粕12%,魚(yú)粉8%,雞蛋3%,其他灰分6%);高脂組,喂養(yǎng)高脂飼料(78.8%普通飼料,豬油10%,蛋黃粉10%,膽固醇1%以及膽鹽0.2%);高糖組,喂養(yǎng)普通飼料+60%的高葡萄糖溶液;蘆丁+高脂組,喂養(yǎng)高脂飼料+蘆丁飽和水溶液;蘆丁+高糖組,喂養(yǎng)普通飼料+混合溶液(60%的高葡萄糖溶液+蘆丁飽和水溶液)。小鼠可自由飲水和攝食。蘆丁+高脂組和蘆丁+高糖組所用蘆丁水溶液為1 g蘆丁溶于1 L ddH2O,每天均超聲半小時(shí)后使用。每日觀察、每周稱重、記錄。

1.3.2 組織采集及處理 適宜實(shí)驗(yàn)環(huán)境飼養(yǎng)120 d后,禁食一晚。摘眼球取血,血液樣本分離血清進(jìn)行分析。處死小鼠后快速解剖,用4%多聚甲醛固定部分分離出大腦組織和海馬組織,作Nissl染色和HE染色,其余腦組織先用液氮冷凍,然后在-80 ℃冰箱中保存,后續(xù)用于相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)和生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.3 腦組織病理學(xué)檢查 大腦皮層區(qū)和海馬區(qū)分離組織,經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋,分別連續(xù)切取4-6 μm厚切片,進(jìn)行尼氏(Nissl)染色(甲苯胺藍(lán) ∶無(wú)水乙醇=1 ∶1,與新鮮的0.1%NaCl溶液混合)和蘇木精-伊紅(HE)染色,室溫下染色30 min,沖洗切片,二甲苯透明,封片,光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

1.3.4 小鼠血清中TG、TC含量測(cè)定 眼眶采集血樣,室溫靜置30 min后,分離血清,用試劑盒測(cè)定血清中TG、TC的含量。

1.3.5 腦組織中MDA含量及抗氧化酶SOD、GSH-Px活性水平測(cè)定 用生理鹽水(0.9%NaCl溶液)洗滌腦組織,剪碎后混勻,制成10%腦組織勻漿,離心10 min后收集上清。測(cè)定腦組織勻漿上清中SOD、GSH-Px活性水平及MDA含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量變化

與正常組相比,高脂組小鼠體質(zhì)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì),第4周開(kāi)始增長(zhǎng)趨勢(shì)較快,第9周開(kāi)始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高脂組相比,蘆丁+高脂組一開(kāi)始就表現(xiàn)出體質(zhì)量增長(zhǎng)較緩,第9周開(kāi)始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表1)。與正常組相比,高糖組小鼠體質(zhì)量也呈增長(zhǎng)趨勢(shì),第9周開(kāi)始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高糖組相比,蘆丁+高糖組表現(xiàn)出體質(zhì)量增長(zhǎng)較緩趨勢(shì),但無(wú)明顯減輕,第12周開(kāi)始差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表2)。

表1 蘆丁干預(yù)高脂飲食喂養(yǎng)小鼠的體質(zhì)量比較

表2 蘆丁干預(yù)高糖飲食喂養(yǎng)小鼠的體質(zhì)量比較

2.2 各組小鼠大腦皮層和海馬區(qū)組織變化

HE染色可見(jiàn),正常組大腦皮層及海馬區(qū)結(jié)構(gòu)完整,形態(tài)正常,神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則,清晰;高脂組和高糖組可見(jiàn)部分神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂,輕度水腫,邊緣有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象;而經(jīng)蘆丁干預(yù)后,蘆丁+高脂組和蘆丁+高糖組水腫減輕,病理?yè)p傷明顯改善(見(jiàn)圖1)。尼氏染色結(jié)果顯示,正常組大腦皮層細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞核淡染,胞質(zhì)中可見(jiàn)大量深染的粗顆粒虎斑狀Nissl小體;高脂組和高糖組小鼠大腦皮層結(jié)構(gòu)變薄,神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,部分細(xì)胞核固縮,虎斑結(jié)構(gòu)明顯減少;而經(jīng)蘆丁干預(yù)后,蘆丁+高脂組和蘆丁+高糖組細(xì)胞排列較高脂組和高糖組規(guī)整,虎斑結(jié)構(gòu)數(shù)量增加(見(jiàn)圖2)。

藍(lán)色箭頭:細(xì)胞排列紊亂;紅色箭頭:輕度水腫、空泡;黑色箭頭:細(xì)胞凋亡、細(xì)胞核固縮。圖1 各組小鼠腦組織形態(tài)學(xué)比較 (×40)Figure 1 Morphological changes of mouse brain tissues in each group (×40)

黑色箭頭:虎斑結(jié)構(gòu);紅色箭頭:輕度水腫、空泡圖2 蘆丁對(duì)各組小鼠大腦皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元分布的影響Figure 2 Effect of rutin on the distribution of neurons in the cerebral cortex and hippocampus of mice in each group

2.3 小鼠大腦組織中總膽固醇(TG)、甘油三酯(TC)的含量變化

HFD組血清中TG、TC含量較正常組均顯著增高(P<0.05),rutin+HFD組TG、TC含量與HFD組相比明顯降低(P<0.05)。與正常組相比,HGD組TG、TC含量無(wú)明顯變化;與HGD組相比,rutin+HGD組TG、TC含量明顯降低(P<0.05,見(jiàn)表3,4)。

表3 蘆丁干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠大腦TG、TC含量的影響

表4 蘆丁干預(yù)對(duì)高糖飲食小鼠大腦TG、TC含量的影響

2.4 蘆丁對(duì)小鼠腦MDA含量和SOD、GSH-Px活性變化的影響

小鼠腦氧化應(yīng)激檢測(cè)結(jié)果顯示,HFD組和HGD組腦組織勻漿中MDA含量顯著高于正常組(P<0.05);經(jīng)蘆丁干預(yù)后,rutin+HFD組MDA含量與HFD組相比恢復(fù)到正常水平(P<0.05),rutin+HGD組MDA含量有所下降,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組相比,HGD組GSH-Px活性水平顯著降低(P<0.05);而rutin+HGD組GSH-Px活性水平與HGD組相比升高(P<0.05,見(jiàn)表5,6)。

表5 蘆丁干預(yù)對(duì)高脂飲食小鼠大腦MDA含量、GSH-Px和T-SOD活性的影響

表6 Rutin干預(yù)對(duì)高糖飲食小鼠大腦MDA含量、GSH-PX和T-SOD活性的影響

3 討論

神經(jīng)組織代謝旺盛,其相關(guān)抗氧化性能較弱,以及由于其所處的高耗氧狀態(tài),大腦相對(duì)于身體其他部分而言更容易受到氧化損傷[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高脂、高糖組小鼠體質(zhì)量明顯增加,TG和TC含量均有增加,大量的脂類和糖類攝入可能造成脂代謝紊亂,從而導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激進(jìn)而促使血液中的TG運(yùn)送到組織器官[8]。蘆丁干預(yù)后,對(duì)脂代謝紊亂改善有積極作用。MDA、SOD和GSH-Px可一同反應(yīng)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平。MDA是用作檢測(cè)和定量包括大腦在內(nèi)的任何機(jī)體組織脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度的代謝產(chǎn)物之一[9,10],SOD能夠比較直觀地反應(yīng)人體抗氧化能力和過(guò)氧化水平[11-13]。高脂組和高糖組腦組織勻漿MDA含量顯著升高,SOD水平明顯下降,經(jīng)蘆丁干預(yù)后,檢測(cè)指標(biāo)恢復(fù)到正常水平。GSH-Px主要通過(guò)催化H2O2及其他脂類氫過(guò)氧化物分解為GSH和水來(lái)減少氫過(guò)氧化物含量,保護(hù)腦細(xì)胞免受氧化損傷,維持細(xì)胞正常形態(tài)[14],因此在高脂組中GSH-Px水平增加。高糖組GSH-Px活性水平降低,則可能與小鼠的氧化應(yīng)激適應(yīng)性有關(guān)[15]。組織切片分析也發(fā)現(xiàn),高脂組和高糖組尼氏體顯著減少,神經(jīng)細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成和包裝的功能可能受到影響,其合成相關(guān)抗氧化酶類功能也相應(yīng)減弱。

現(xiàn)有研究認(rèn)為,在持續(xù)高脂高糖條件下,腦組織的線粒體功能障礙[16],其結(jié)果是過(guò)多的氧自由基在腦組織逐漸積累,由于細(xì)胞中的核酸、蛋白質(zhì)等分子結(jié)構(gòu)被破壞,進(jìn)而引起神經(jīng)細(xì)胞功能損傷甚至死亡[17],造成神經(jīng)元病理改變[18],這與本研究的腦組織染色結(jié)果相同。Rubiolo等[19]研究發(fā)現(xiàn),維持機(jī)體氧化還原動(dòng)態(tài)平衡需要自由基參與,抗氧化酶與自由基相互作用,使自由基毒性減少,水溶性增加,從而促進(jìn)自由基清除。當(dāng)抗氧化酶類受到氧化應(yīng)激損傷時(shí),需要外源化學(xué)物質(zhì)改善氧化水平,蘆丁保護(hù)組的保護(hù)作用可能是蘆丁通過(guò)將氫原子推向超氧陰離子自由基、過(guò)氧自由基和羥基來(lái)清除腦內(nèi)的氧自由基,以減輕腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平[20]。同時(shí),通過(guò)對(duì)小鼠行為變化觀察發(fā)現(xiàn),高脂組和高糖組小鼠出現(xiàn)了行動(dòng)遲緩,嗜睡現(xiàn)象,這可能是因脂質(zhì)過(guò)氧化損傷,逐漸受損的大腦皮層功能區(qū)導(dǎo)致正常認(rèn)知修復(fù)功能減退[21]。

本研究的不足之處在于本實(shí)驗(yàn)沒(méi)有對(duì)小鼠攝食量進(jìn)行精確的統(tǒng)計(jì)與記錄,不能完全排除rutin影響攝食量從而對(duì)體質(zhì)量及氧化產(chǎn)物等產(chǎn)生影響的可能性。這是我們實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)之初沒(méi)有考慮到的地方,也使整個(gè)實(shí)驗(yàn)存在一定的不嚴(yán)謹(jǐn)之處。我們會(huì)在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中完善這方面的設(shè)計(jì),使得實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn),結(jié)果更加可靠。

綜上所述,蘆丁在小鼠大腦氧化損傷中所起到的顯著保護(hù)作用,很可能歸因于其上調(diào)了抗氧化酶類表達(dá),在一定程度上減輕了腦組織神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,為蘆丁在高脂高糖飲食誘導(dǎo)的小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。因此,蘆丁對(duì)大腦氧化應(yīng)激損傷的治療潛能及具體機(jī)制,還需要更多的實(shí)驗(yàn)研究證據(jù)支持,尤其是臨床研究。