芍藥甘草湯對炎癥后腸易激綜合征大鼠的干預作用和機制研究

武 蓓,常壯鵬,鄧貴鳳,2,邵云云*

(1山西醫科大學第二醫院藥學部,太原 030001;2山西醫科大學藥學院臨床藥學室;*通訊作者,E-mail:shaoyunyun4466@163.com)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome,IBS)是一種常見的功能性胃腸道疾病,伴有腹痛和腹部脹大,煩躁不安和/或糞便性狀改變等主要臨床表現[1]。流行病學調查顯示,在我國IBS發病率約為5%-6%,其中由胃腸道炎癥引起的IBS又叫炎癥后IBS(post-inflammatory IBS,PI-IBS),約占IBS總病例的1/3[2]。PI-IBS指急性胃腸道炎癥恢復后仍存在持續的IBS癥狀,以腹痛和腹瀉為主,嚴重影響患者生活質量和增加經濟負擔[3]。目前PI-IBS的病因尚不完全明確,多認為與內臟痛覺高敏感型、低度炎癥、腦-腸軸超敏反應或腸道感染等有關[4]。由于其復雜的發病機制,臨床上治療PI-IBS多為對癥治療(如東莨菪堿、復方地芬諾酯等),療效不確切且長期應用會產生較大副作用[5]。中醫因其辨病與辨證相結合,整體調整,可彌補西醫治療方案的不足,減少西藥長期服用的不良反應,在PI-IBS治療方面有獨特優勢。芍藥甘草湯(Shaoyao Gancao decoction,SGD)是著名的中藥經典方劑,出自漢代張仲景的《傷寒論》,由白芍和甘草兩味中藥組成,有柔筋止痛之效,傳統用于多種痛癥和炎癥疾病的治療[6]。現代藥理學研究表明,SGD主要成分如芍藥苷和甘草次酸等均有解痙鎮痛的作用[7,8],本課題組最近也發現SGD可以明顯改善PI-IBS大鼠的腹痛腹瀉癥狀[9],但由于SGD成分眾多、作用靶點復雜,因此目前有關其治療PI-IBS的分子機制尚不完全清楚,難以有效進行療效評價,成為限制其現代化和臨床應用的瓶頸。

代謝組學主要研究機體內源性代謝物質整體變化規律,與中醫的整體觀念和辨證思維相一致。利用系統代謝組學研究方法篩選出組織和體液中多種代謝產物及活性成分,進而發現藥物作用靶點,充分發掘中藥復方的整體性作用機制和療效。本研究旨在探討SGD對PI-IBS大鼠的干預作用,并基于代謝組學研究大鼠血漿內源性代謝產物的差異,以期為中藥治療PI-IBS作用機制的研究提供客觀依據和新思路。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SD大鼠18只,體質量(200±20)g,購于國家食品藥品檢定研究院實驗動物中心,合格證號:SCXK(京)2014-0013。空氣溫度25 ℃,12 h明暗交替,大鼠可以自由進食和飲水。

1.2 藥物與試劑

白芍(安徽精誠本草中藥飲片有限公司)、甘草(國藥樂仁堂河北藥業有限公司)飲片經山西醫科大學第二醫院張京平中藥師鑒定為正品,2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS,美國Sigma公司),色譜甲醇(美國Fisher公司)。

1.3 儀器

超高效液相色譜儀(日本島津公司),四級桿飛行時間質譜儀Q-TOF(美國AB Sciex公司),DZF-6050型真空干燥箱(蘇州江東精密儀器公司),Kinetex XB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.6 μm),高速離心機(德國Biofuge公司),真空干燥箱(蘇州江東精密儀器公司)。

1.4 芍藥甘草湯的制備

稱取白芍和甘草飲片,按照質量1 ∶1比例混合,加入10倍量的無菌雙蒸水,浸泡1 h,然后煎煮3次,每次1 h。合并濾液,濃縮至2.12 g/ml,放置在4 ℃冰箱中保存。

1.5 動物模型制備及給藥

大鼠適應性喂養1周后,隨機分為正常組、PI-IBS模型組和芍藥甘草湯(SGD)組,每組6只。按照課題組前期方法[9]進行造模處理:大鼠禁食過夜后,通過塑料導管將TNBS溶液(0.8 ml/只)注入結腸中造模28 d,同時正常組大鼠給予等量的生理鹽水,造模后通過測定大鼠的疾病活動指數(DAI)和內臟痛閾值評定模型制備是否成功。本課題組前期采用SGD低、中、高劑量[6.25,12.5,25 g/(kg·d)]對PI-IBS大鼠給藥后發現高劑量組療效最為顯著[9],故本實驗造模結束后SGD組給予25 g/(kg·d)灌胃給藥14 d。

1.6 大鼠DAI值和內臟痛閾值的測定

記錄大鼠造模及給藥SGD后體質量變化率、糞便潛血量和糞便性狀,共42 d,計算三者評分的均值,得到大鼠的DAI值。采用腹壁回縮反射實驗檢測大鼠的內臟痛閾值,將氣囊導管導入結腸,大鼠適應30 min后,逐漸加壓,直到觀察到腹壁明顯收縮,記錄此時壓力值為內臟痛閾值。

1.7 大鼠結腸組織病理學考察及病理損傷評分

末次給藥24 h后,腹主動脈取血,4 000 r/min離心10 min取上清,-80 ℃保存備用。收集結腸組織,置于4%的甲醛溶液中固定,依次使用70%,80%,90%,95%的乙醇,二甲苯常規脫水,石蠟包埋,采用蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡觀察大鼠結腸組織病理形態學變化并依照參考文獻[10]進行病理損傷評分。

1.8 血漿樣本的處理

取各組大鼠血漿100 μl,加入300 μl甲醇渦旋震蕩3 min,13 000 r/min離心10 min,取上清液真空干燥(37 ℃),100 μl甲醇復溶,渦旋3 min,13 000 r/min離心10 min,取上清待測。

1.9 檢測條件

1.9.1 色譜條件 流動相水(A)和甲醇(B)梯度洗脫(0-2.0 min,5%B;2.0-8.0 min,5%-15%B;8.0-13.0 min,15%B;13.0-17.0 min,15%-30%B;17.0-22.0 min,30%B;22.0-26.0 min,30%-95%B;26.0-28.0 min,95%B;28.0-28.2 min,95%-5%B;28.2-30.0 min,5%B),流速0.3 ml/min,進樣量5 μl。

1.9.2 質譜條件 采用正離子(ESI+)/負離子(ESI-)模式,離子源參數設置:氣簾氣40 psi;離子化電壓為5 500 V(ESI+)/4 500 V(ESI-);噴霧氣50 psi;輔助加熱氣50 psi;溫度500 ℃。

1.10 統計學分析

采用MarkerView1.3軟件處理數據,導入SIMCA-P13.0軟件進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘方-判別分析(OPLS-DA)。通過VIP>1且P<0.05篩選正常組與PI-IBS組的差異代謝物,將代謝差異物導入MetaboAnalyst數據庫進行代謝通路分析。實驗數據采用SPSS 22.0處理,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠DAI值和內臟痛閾值的測定

正常組大鼠體質量逐步增加,糞便性狀正常,無潛血,平均DAI值偏低;與正常組比較,模型組大鼠在TNBS造模后體質量明顯下降,出現稀便且大便潛血嚴重,平均DAI值明顯增加(P<0.05);與模型組比較,SGD組給藥后大鼠DAI值明顯降低(P<0.05,見圖1)。同時,與正常組大鼠相比,模型組大鼠內臟痛閾值明顯下降(P<0.05),表明存在內臟高敏感性;與模型組比較,SGD組給藥后大鼠內臟痛閾值明顯提高(P<0.05,見圖1)。以上結果表明PI-IBS大鼠模型制備成功,SGD可明顯降低PI-IBS大鼠的DAI值和內臟痛覺高敏感性。

與正常組比較,***P<0.001;與模型組比較,###P<0.001圖1 各組大鼠DAI值和內臟痛閾值比較Figure 1 Comparison of DAI and visceral pain threshold of rats between groups

2.2 各組大鼠結腸組織病理學改變及病理損傷評分

正常組大鼠可觀察到腸黏膜組織完整、表面光滑,上皮細胞排列整齊有序,未見炎性浸潤損傷;模型組大鼠結腸組織明顯增厚、充血和腫脹,大部分腺體結構消失,腸黏膜下層表現輕度充血和水腫;與模型組相比,SGD組大鼠結腸損傷明顯改善,腸黏膜趨于完整且排列整齊,未見炎癥細胞浸潤,與正常組結構相似(見圖2)。與正常組相比,模型組大鼠結腸組織病理損傷評分明顯增加(P<0.05);與模型組比較,SGD組給藥后病理損傷評分明顯降低(P<0.05,見圖2)。

與正常組比較,***P<0.001;與模型組比較,###P<0.001圖2 各組大鼠結腸組織病理學改變與病理評分比較 (HE,×100)Figure 2 Comparison of histopathological changes and pathological scores in the colon of rats between groups (HE,×100)

2.3 大鼠血漿代謝物PCA分析

在ESI+或ESI-下對正常組、PI-IBS組及SGD組大鼠血漿代謝物進行PCA分析。在ESI+下,R2X為0.469,Q2為0.0731;在ESI-下,R2X為0.452,Q2為0.101,提示本次研究模型預測性和解釋性較好。血漿代謝物空間分布結果顯示各組樣本區分較好(見圖3),表明組間代謝物差異可有效辨別。

A. ESI+模式下PCA主成分分析圖 B. ESI-模式下PCA主成分分析圖 圖3 各組大鼠血漿代謝物PCA分析Figure 3 PCA analysis of plasma metabolites of rats in each group

2.4 大鼠血漿代謝物OPLS-DA分析

在ESI+或ESI-下對大鼠血漿代謝物進行OPLS-DA分析。結果顯示正常組和PI-IBS組,PI-IBS組和SGD組間均明顯分離(見圖4),可用于進一步尋找和分析組間差異成分。

圖4 各組大鼠血漿代謝物OPLS-DA分析Figure 4 OPLS-DA analysis of plasma metabolites of rats in each group

2.5 大鼠血漿差異代謝物的鑒定

采用UPLC-Q/TOF-MS方法對大鼠血漿內源性代謝產物進行檢測,結合OPLS-DA分析,正常組和PI-IBS組大鼠血漿共鑒定出30個差異代謝物(VIP>1且P<0.05);經SGD干預后,有14個差異代謝物回調到正常水平(見表1)。

表1 PI-IBS組與正常組大鼠血漿差異代謝物 (未完待續)

2.6 SGD作用于PI-IBS大鼠的代謝通路分析

正常組與PI-IBS組的差異代謝物經MetaboAna-lyst進行通路富集分析,發現PI-IBS大鼠主要有7條代謝通路發生異常改變,SGD干預后能夠調節其中的5條代謝通路,包括嘧啶代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,嘌呤代謝,乙醛酸和二羧酸的代謝和三羧酸(TCA)循環(見圖5)。

A.PI-IBS大鼠疾病條件下異常的血漿代謝通路分析圖 B.SGD干預PI-IBS的血漿代謝通路分析圖圖5 代謝通路分析Figure 5 Metabolic pathway analysis

3 討論

PI-IBS是一種常見的功能性胃腸道疾病,病因復雜多樣。中醫學中,PI-IBS屬于“腹痛”“泄瀉”等范疇,基本病機為肝郁氣滯、脾胃不和、脾虛濕盛,進而引起腸道氣機不利,傳導失司[11]。調肝脾是治療該病的關鍵治法,除濕止瀉是治療該病的必要手段。SGD方中白芍性微寒,歸肝、脾經,有柔肝止痛之用,主治血虛腹痛、脅痛、痢疾等;甘草性平,歸脾、胃經,有補脾益氣之用,主治脾胃氣虛、脘腹、攣急疼痛等,與白芍合用,可顯著增強治腹痛腹瀉的療效[12]。近年來大量文獻報道,SGD對胃腸痙攣性腹痛、IBS等有非常好的療效[13]。本研究結果也顯示SGD可顯著改善PI-IBS大鼠排便異常癥狀,同時降低內臟痛覺高敏感性,減輕結腸黏膜損傷,療效明顯,與本課題組前期研究結果一致[9],但其作用機制尚不完全明確。

代謝組學的整體性思路與中醫的系統觀、整體觀不謀而合,先進的代謝組學分析技術為中藥復方多層次、多靶點治療的作用機制研究提供了新思路與新方法。在本研究中,通過對正常組、PI-IBS組及SGD組大鼠血漿樣本進行代謝組學分析,發現PI-IBS大鼠體內有30種代謝物水平發生明顯改變,而灌胃給予SGD后,這些差異代謝物中有14種恢復至正常水平,包括哌可啉酸、谷氨酰胺、亮氨酸、肉毒堿、乙酰半胱氨酸、甲基組氨酸、腺苷、尿酸、葡萄糖、羥基異己酸、胸苷、檸檬酸鹽、泛酸鹽、尿苷,可能涉及嘧啶代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,嘌呤代謝,乙醛酸和二羧酸的代謝和TCA循環等多條通路。

嘧啶代謝和嘌呤代謝主要以谷氨酰胺等為原料,腺苷、胸苷、鳥苷等為中間產物,最終合成嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸。這兩種代謝過程受一系列因子調控,當某一環節出現問題時會發生代謝紊亂,從而引發免疫系統、神經系統等多種疾病[14]。洪宗超等[15]報道潰瘍性結腸炎大鼠體內嘧啶和嘌呤代謝發生異常。此外,孫倩倩[16]研究發現中藥半夏瀉心湯可通過調節嘧啶和嘌呤代謝恢復血清鳥苷、腺苷等水平進而抑制慢性萎縮性胃炎大鼠炎癥反應的發生。本研究結果顯示SGD組大鼠血漿腺苷、胸苷、尿苷水平相較于PI-IBS組明顯上調,提示SGD也可能通過促進PI-IBS大鼠嘧啶和嘌呤代謝的恢復改善結腸炎癥。

本研究還發現SGD治療PI-IBS與其調節丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等多種氨基酸代謝有關。氨基酸是腸道細胞生長和分化必要的營養物質,也是腸道微生物合成蛋白質、嘧啶和嘌呤核苷酸及多種信號分子的必需前體和促進劑。腸道氨基酸代謝對維持腸細胞營養、保護腸黏膜屏障、調節腸免疫功能至關重要[17]。因此,SGD可能通過對氨基酸代謝的調控促進腸黏膜修復和減少炎癥反應。

TCA循環是糖類、脂類及氨基酸的最終代謝通路,也是此三大營養物質代謝聯系的樞紐,對于腸道細胞能量的獲取至關重要[15]。本研究結果顯示PI-IBS大鼠體內葡萄糖含量明顯增加,TCA循環被抑制,其中間代謝產物檸檬酸明顯減少,線粒體供能不足,ATP生成減少,導致腸道免疫細胞和屏障細胞抗感染、抗侵襲和抗凋亡能力減弱,造成腸道損傷。有研究表明甘草配伍入藥后可通過影響TCA循環改善潰瘍性結腸炎大鼠癥狀[15],故本研究中SGD也可能通過增加PI-IBS大鼠檸檬酸水平促進TCA循環,為腸道細胞正常發揮腸道保護作用提供能量。此外,在能量代謝中,我們還發現SGD影響了PI-IBS大鼠體內乙醛酸和二羧酸的代謝,此為TCA循環的支路,可補充某些中間代謝產物的不足,對于腸道微生物的代謝起著重要的作用。研究顯示腸道菌群失調會產生多種有害代謝產物從而損傷腸道黏膜,與IBS的發生發展關系密切[18]。此外,本課題組前期研究結果表明SGD可以通過調節腸道菌群減少LPS的釋放,并且降低腸道通透性,提示本研究中SGD可能通過影響腸道菌群代謝平衡進而減輕腸道損傷,改善PI-IBS癥狀。

綜上所述,本研究發現SGD能夠明顯改善TNBS誘導的PI-IBS大鼠癥狀。進一步采用UPLC-Q/TOF-MS和代謝組學技術分析,推測SGD干預PI-IBS大鼠的機制涉及嘧啶代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,嘌呤代謝,乙醛酸和二羧酸的代謝和TCA循環等多條通路,但其具體作用機制仍需在后續實驗中進一步驗證。本研究一定程度上為該中藥復方有效治療PI-IBS提供了現代理論基礎和科學依據。