上調lncRNA OIP5-AS1通過靶向miR-181d-5p減少脂多糖誘導的心肌細胞損傷

陳健佳,張小梅,馬文斌,黃玉梅,趙 強

(廣州醫科大學附屬順德醫院心內科,佛山 528315;*通訊作者,E-mail:326400975@qq.com)

心肌炎是一種會導致心臟功能障礙的心肌炎癥性疾病,病因包括免疫損傷、感染等,可顯著影響心臟的收縮和舒張功能,導致心律失常[1]。心肌炎的診斷主要依賴于免疫學、免疫組織化學及組織病理學[2]。心肌炎的具體發病機制目前并不明確,探究心肌炎的分子靶向治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類超過200個核苷酸組成的內源性小分子RNA,屬于單鏈非編碼RNA[3]。lncRNA參與調控血管生成、細胞分化、細胞增殖、細胞凋亡等各種細胞功能[4,5]。lncRNA廣泛參與各種心臟疾病的發生、發展過程[6]。研究表明,OIP5-AS1是一種lncRNA,其可通過抑制線粒體介導的細胞凋亡,降低急性心肌梗死后的心肌缺血再灌注損傷[7]。OIP5-AS1對細菌性心肌炎時心肌細胞損傷的研究尚未見報道。本研究旨在觀察OIP5-AS1對脂多糖誘導細菌性心肌炎時對大鼠原代心肌細胞的作用及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 細胞與試劑

用于分離原代心肌細胞的3 d新生SD大鼠購于武漢萬千佳興生物科技有限公司。載有OIP5-AS1序列的GFP慢病毒、空載GFP慢病毒、miR-NC、miR-181d-5p、OIP5-AS1野生型及突變型熒光報告載體購于廣州銳博生物技術有限公司。工具293細胞、ELISA試劑盒和CCK-8試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司。胎牛血清、DMEM培養基購于美國Hyclone公司。Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。轉染試劑LipofectamineTM3000購于美國Invitrogen公司。膠原酶Ⅰ購于美國Sigma公司。實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購于日本Takara公司。一抗和二抗購于美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞分離、培養和分組

采用膠原酶Ⅰ將3 d新生SD大鼠的心臟組織解離為單細胞懸液,加入含20%胎牛血清的DMEM培養基中,在37 ℃、5% CO2條件下培養。將大鼠原代心肌細胞分為兩組:分別感染空載GFP慢病毒和載有OIP5-AS1序列的GFP慢病毒,感染復數(MOI)均為20,命名為對照組和實驗組。12 h后熒光顯微鏡下觀察細胞狀態。每組細胞分別滴加100 μl濃度為10 μmol/L脂多糖,24 h進行后續實驗。

1.3 qRT-PCR檢測OIP5-AS1和miR-181d-5p的表達

TRIzol法提取細胞總RNA,逆轉錄為cDNA進行qRT-PCR檢測。反應參數:96 ℃預變惈3 min,96 ℃變性20 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,35個循環。OIP5-AS1的表達以β-actin為內參,miR-181d-5p的表達以U6為內參。引物序列如下:miR-181d-5p正向引物為AACAUUCAUUGUUGUC,反向引物為CGACGTGTAGTGTTTCCTA;U6正向引物位CTCGCTTCGGCAGCACA,反向引物為ACGCTTCACGAATTTGCGT。β-actin正向引物為TGTCACCAACTGGGACGATA,反向引物位GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA;OIP5-AS1正向引物為GTGTTGTGGAGATTGAGGCAGGAG,反向引物為GGCAAGGTGAAGGACAGACAGC。以2-ΔΔCt法計算OIP5-AS1和miR-181d-5p的相對表達。

1.4 ELISA法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細胞介素1β(IL-1β)含量

大鼠原代心肌細胞經脂多糖處理24 h后,收集各組細胞的上清,根據ELISA試劑盒說明書進行操作,在酶標儀450 nm波長處檢測每孔吸光度(A)值,比較每組細胞上清液中TNF-α和IL-1β的含量。

1.5 CCK-8法檢測細胞活力

將經脂多糖處理后的大鼠原代心肌細胞以每孔1×103個細胞接種于96孔板,設置4個復孔。24 h后,每孔加入20 μl CCK-8試劑,繼續培養4 h,在酶標儀450 nm波長處檢測每孔吸光度(A)值,比較各孔的細胞活力。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率

胰酶消化經脂多糖處理后的大鼠原代心肌細胞,采用預冷的PBS溶液洗2次,采用緩沖液重懸,分別取100 μl細胞懸液加入流式管,分別加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC試劑和5 μl PI試劑,混勻后避光孵育25 min。加入100 μl緩沖液,流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 生物信息學方法預測和雙熒光素酶報告基因實驗驗證OIP5-AS1的靶基因

采用生物信息學軟件Starbase預測OIP5-AS1的潛在靶向基因。采用LipofectamineTM3000轉染試劑，將OIP5-AS1野生型和突變型熒光報告載體分別和miR-NC或miR-181d-5p共轉染工具293細胞,24 h后根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作,檢測每組細胞的相對熒光素酶活性。

1.8 Western blot法檢測凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達

對照組和實驗組細胞分別滴加100 μl濃度為10 μmol/L脂多糖誘導心肌細胞損傷,24 h后采用預冷的PBS溶液洗2次,采用細胞裂解液提取總蛋白。蛋白變性后,采用十二烷基聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉至硝酸纖維素膜,采用5%脫脂牛奶進行封閉,在4 ℃冰箱內采用一抗Bcl-2(稀釋度1 ∶2 000)、Bax(稀釋度1 ∶1 000)、Caspase-3(稀釋度1 ∶1 000)孵育過夜,在室溫下采用二抗孵育2 h。均勻滴加增強型化學發光試劑,在凝膠成像系統中曝光、拍照。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 兩組細胞中OIP5-AS1的相對表達

對照組和實驗組細胞均顯著表達綠色熒光蛋白(見圖1),提示細胞感染成功。對照組和實驗組細胞中OIP5-AS1相對表達分別為1.01±0.07和9.22±1.06,實驗組OIP5-AS1相對表達明顯高于對照組(P<0.01,見圖2)。

圖1 對照組和實驗組細胞綠色熒光蛋白表達Figure 1 The expression of green fluorescent protein in control group and experimental group

與對照組比較,**P<0.01圖2 對照組和實驗組細胞中OIP5-AS1的相對表達Figure 2 The relative expression of OIP5-AS1 in control group and experimental group

2.2 高表達OIP5-AS1對TNF-α和IL-1β含量的影響

ELISA法結果顯示,脂多糖處理后對照組和實驗組培養基中TNF-α含量分別為(39.45±2.15)pg/ml和(30.26±1.85)pg/ml,兩組間比較差異有統計學意義(P<0.05);對照組和實驗組培養基中IL-1β含量分別為(22.49±1.50)pg/ml和(12.34±1.77)pg/ml,兩組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。與對照組相比,實驗組培養基中TNF-α和IL-1β含量均明顯降低。

2.3 高表達OIP5-AS1對細胞活力的影響

CCK-8法結果顯示,脂多糖處理后的對照組和實驗組細胞活力分別為1.00±0.02和5.89±0.61,與對照組相比,實驗組細胞的活力明顯較高(P<0.01)。

2.4 高表達OIP5-AS1對細胞凋亡率的影響

流式細胞術顯示,脂多糖處理24 h后,實驗組和對照組細胞凋亡率分別為(22.70±1.88)%和(48.64±2.37)%;與對照組比較,實驗組高表達OIP5-AS1明顯抑制細胞的凋亡,差異具有統計學意義(P<0.01,見圖3)。

與對照組比較,**P<0.01圖3 流式細胞術檢測OIP5-AS1對細胞凋亡率的影響Figure 3 The effect of OIP5-AS1 on cell apoptosis rate was detected by flow cytometry

2.5 生物信息學方法預測OIP5-AS1的靶基因

采用生物信息學軟件Starbase預測OIP5-AS1可靶向結合miR-181d-5p(見圖4)。

圖4 生物信息學方法預測OIP5-AS1的靶基因Figure 4 Bioinformatics methods predicted the target gene of OIP5-AS1

2.6 OIP5-AS1與miR-181d-5p的靶向關系

雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示，野生型miR-NC組、野生型miR-181d-5p組、突變型miR-NC組和突變型miR-181d-5p組的相對熒光素酶活性分別為1.02±0.08、0.30±0.04、1.08±0.15和1.01±0.06，野生型miR-181d-5p組較野生型miR-NC組明顯降低(P<0.01，見圖5)，證實OIP5-AS1與miR-181d-5p之間可靶向結合。

與野生型miR-NC組比較,**P<0.01圖5 雙熒光素酶報告基因實驗驗證OIP5-AS1與miR-181d-5p的靶向關系Figure 5 The dual luciferase reporter gene experiment verified the targeting relationship between OIP5-AS1 and miR-181d-5p

2.7 高表達OIP5-AS1對細胞中miR-181d-5p表達的影響

qRT-PCR結果顯示,實驗組和對照組細胞miR-181d-5p的表達分別為0.19±0.06和1.01±0.06,高表達OIP5-AS1可抑制miR-181d-5p的表達(P<0.01)。

2.8 高表達OIP5-AS1對凋亡相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,與對照組相比,脂多糖處理的高表達OIP5-AS1的細胞中,抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加,促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達下降(見圖6)。

圖6 Western blot法檢測高表達OIP5-AS1后凋亡相關蛋白的表達Figure 6 Expression of apoptosis-related proteins after OIP5-AS1 overexpression by Western blot

3 討論

近年的研究表明,lncRNA在各種心血管事件的發生、發展過程中具有重要調控作用[8,9]。心肌炎導致炎性滲出,心肌細胞耗氧量增加,心肌細胞更易凋亡,導致惡性臨床事件[10]。lncRNA介導的心肌細胞損傷被廣泛的研究。Zhang等[11]研究發現,lncRNA ROR通過調節C-Myc蛋白的表達,促進病毒性心肌炎大鼠心肌的纖維化。Cao等[12]研究發現,在柯薩奇病毒B3誘導的心肌炎中,lncRNA HIF1A-AS1的表達明顯增加,沉默lncRNA HIF1A-AS1可抑制心肌細胞的凋亡,miR-138是lncRNA HIF1A-AS1的靶基因。Niu等[7]研究發現,OIP5-AS1在心臟缺血再灌注心肌細胞中的表達下調,過表達OIP5-AS1可減輕活性氧引起的線粒體損傷,降低心肌細胞的凋亡。OIP5-AS1對細菌性心肌炎時心肌細胞的影響及作用機制尚不明確。

本研究顯示,OIP5-AS1可增加細菌性心肌炎心肌細胞的活力,上調OIP5-AS1可抑制TNF-α和IL-1β炎癥因子的滲出,降低心肌細胞的凋亡率,減輕心肌細胞的損傷。越來越多的研究表明,lncRNA主要通過“海綿作用”結合微小RNA(miRNA),降低miRNA的表達,進而抑制miRNA的功能[13-15]。本研究采用生物信息學軟件Starbase預測,OIP5-AS1的靶基因可能是miR-181d-5p。雙熒光素素酶報告基因檢測顯示,OIP5-AS1可配對結合miR-181d-5p。研究表明,miR-181d-5p在急性病毒性心肌病患者血清外泌體中的表達顯著增加,miR-181d-5p可增強心肌的炎癥反應,促進心肌細胞的凋亡和不可逆損傷[16]。本研究顯示,OIP5-AS1表達增加后,脂多糖處理的心肌細胞中miR-181d-5p的表達降低,OIP5-AS1可明顯抑制miR-181d-5p的表達。本研究通過Western blot檢測顯示,高表達OIP5-AS1的心肌細胞中Bcl-2蛋白表達增加,Bax、Caspase-3蛋白表達減少,提示OIP5-AS1抑制miR-181d-5p表達后心肌細胞凋亡明顯減少。

綜上所述,OIP5-AS1可有效增強脂多糖處理的心肌細胞的活力并抑制其凋亡,OIP5-AS1主要通過抑制miR-181d-5p表達發揮作用。本研究首次揭示OIP5-AS1可能有利于改善細菌性心肌炎心肌細胞的功能,為細菌性心肌炎的分子靶向治療提供了新的方向。