TRIM22在神經膠質瘤中致癌作用的機制研究

劉華鋒,王 超*,張 偉,張 明,夏 毅

(1空軍軍醫大學唐都醫院神經外科,西安 710038;2陜西省康復醫院病理科;*通訊作者,E-mail:hzchenjin1971@163.com)

神經膠質瘤是中樞神經系統腫瘤中的一種高異質性腫瘤,起源于腦內膠質細胞[1]。大多數神經膠質瘤,即彌漫性神經膠質瘤,在中樞神經系統實質中顯示出廣泛的浸潤;約占所有惡性腦腫瘤中的80%[2]。彌漫性神經膠質瘤根據世界衛生組織(WHO)進一步分為Ⅱ級(低級)、Ⅲ級(間變性)或Ⅳ級(膠質母細胞瘤)的星形膠質細胞,少突膠質細胞或罕見的混合少突膠質細胞-星形膠質細胞[3]。目前治療膠質瘤的方法多樣,一般都是結合手術加放療或化療的綜合治療方案。然而膠質瘤的復發率高,雖然可通過磁共振成像進行檢測,但它只能在宏觀水平上顯示腫瘤,所以仍需要探索一種新的治療膠質瘤的方法。

含3個motif基序(tripartite motif,TRIM)家族有70多個成員;它們的共同結構特征是保守的RING指、B-box和卷曲螺旋結構域[4]。據文獻報道,TRIM蛋白對細胞增殖、分化和凋亡、調節其他基因的轉錄以及參與蛋白質的泛素化有很大作用[5]。TRIM家族的TRIM31是TRIM家族的一員,是E3泛素蛋白連接酶,最初被鑒定為由生長抑制性類維生素A誘導的基因[6]。據文獻報道,TRIM在腫瘤進展中起作用,例如促進結直腸癌、膽囊癌和肝細胞癌的生長,同時可以抑制非小細胞肺癌的癌變[6,7]。然而,目前對TRIM在神經膠質瘤發展中的分子機制研究較少,本研究旨在探討TRIM22在膠質瘤中的表達模式及其功能。

1 材料和方法

1.1 材料和組織樣本

本實驗所用細胞系HEB、A172、U251和U87均購自美國ATCC菌株保存庫;DMEM培養基、Trizol試劑盒、cDNA逆轉錄試劑盒、SYBR?Green PCR Master Mix試劑盒、BCA蛋白分析試劑盒、化學增光劑和細胞計數試劑盒-8購于Thermo fisher公司(美國);RIPA裂解緩沖液購于Invitgen公司(美國);一抗和二抗購于Sigma(美國)、Thermo fisher(美國)和Abcam公司(英國);TRIM22的shRNA序列由上海生工生物有限公司(中國)合成;嘌呤霉素購于Sigma公司(美國);Transwell板購于Corning公司(美國)。

本研究收集了2018年5月至2020年3月在唐都醫院接受手術治療的30例膠質瘤患者的膠質瘤組織以及膠質瘤旁正常組織,患者的平均年齡為44.35±2.67歲。本研究嚴格按照美國國立衛生研究院(NIH)出版物“實驗標本組織提取使用指南”[8]進行,并經本院倫理委員會批準(No.2018-3-16-SW0181),所有患者均被告知并簽署了知情同意書。

1.2 細胞培養和qRT-PCR分析

正常小膠質細胞系HEB和膠質瘤細胞系A172、U251、U87均在含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養基(DMEM)中培養,其培養環境為37 ℃、5% CO2;根據細胞培養特性,每2-3 d更換1次培養基。

表1 qRT-PCR分析序所需引物序列

1.3 Western blotting分析TRIM22、E-cadherin、Vimentin、cyclin D1和cMyc蛋白表達水平

使用RIPA裂解緩沖液提取膠質瘤組織樣本和細胞中的總蛋白;采用BCA蛋白分析試劑盒測定提取總蛋白的濃度。將蛋白質與2×上樣緩沖液混合,于沸水浴10 min后制成上樣樣品;使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白(上樣量大約為25 μg),然后轉膜至PMDF膜上。隨后,在室溫下用5%脫脂牛奶封閉PMDF膜1 h。將膜與抗TRIM22(1 ∶2 000)、E-鈣粘連蛋白(E-cadherin,1 ∶2 000)、波形蛋白(Vimentin,1 ∶2 000)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1,1 ∶2 000)、cMyc(1 ∶2 000)或β-肌動蛋白(β-actin,1 ∶500)的一抗在4 ℃下孵育過夜,然后將膜先利用TBST洗膜3次,每次10 min;再將膜與各自的辣根過氧化物酶(HPR)偶聯的二抗(1 ∶2 000)于室溫孵育2 h。最后通過使用化學增光劑(ECL)及檢測軟件(Bio-Rad公司)分析條帶強度。

1.4 sh-TRIM22轉染及分組

通過將PCR擴增的全長TRIM22 cDNA克隆到pMSCV逆轉錄病毒載體中,構建TRIM22的過表達質粒。sh-TRIM22的序列:5′-UAAGCUGGCCUCUUGACUAUC-3′;對照shRNA的序列:5′-CCCCUUUUAAAAAAAGGGGCCCGG-3′。將pMSCV-TRIM22質粒和sh-TRIM22或對照shRNA共轉染U87細胞;其轉染方法采用Lipofectamine 2000進行細胞瞬時轉染實驗。根據以上實驗需求,為驗證敲除TRIM22基因后,對U87細胞的增殖、遷移和侵襲的影響,將實驗分為3組:Con-shRNA組、shRNA-TRIM22組和shRNA-TRIM22+LiCl組。Con-shRNA組細胞共轉染pMSCV-TRIM22質粒和對照shRNA,shRNA-TRIM22組細胞共轉染pMSCV-TRIM22質粒和sh-TRIM22,shRNA-TRIM22+LiCl組細胞共轉染10 μmol/L LiCl+pMSCV-TRIM22質粒和sh-TRIM22(作為激活劑組)。

1.5 細胞增殖實驗

根據使用說明書,利用細胞計數試劑盒-8(CCK-8)法檢測細胞增殖。將U87細胞接種于96孔板中,當細胞密度為1×104個/孔時,分別于0,12,24,36,48,72 h加入10 ml CCK-8溶液,37 ℃孵育1 h后,使用Thermo酶標儀在450 nm波長處測定吸光度。

1.6 細胞遷移和侵襲分析

使用孔徑為8 mm的Transwell板進行Transwell試驗,并檢測細胞侵襲和遷移能力。將每毫升含1×105個U87細胞濃度的DMEM培養基(不含FBS,大約為100 μl)加入Transwell板上室,包被基質(用于侵襲實驗)或不包被基質(用于遷移實驗)。下室加入含10% FBS的DMEM培養基。在孵育24 h后,去除頂部(未遷移)細胞,用4%甲醇處理20 min,再用0.1%結晶紫染色15 min。最后在顯微鏡(Nikon)下隨機選擇5個區域,并進行細胞計數,計算平均細胞數量。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 TRIM22在膠質瘤患者組織樣本和細胞系中高表達

與膠質瘤旁正常組織相比,膠質瘤患者組織樣本中TRIM22的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01)。與正常小膠質細胞系HEB細胞相比,膠質瘤細胞系A172、U251和U87中TRIM22的mRNA和蛋白表達水平顯著升高(均P<0.01,見圖1),其中U87細胞系差異性最為顯著,后續實驗選擇U87細胞系為研究對象。

與膠質瘤旁正常組織相比,*P<0.05;與正常小膠質細胞系HEB細胞相比,*P<0.05,**P<0.01圖1 TRIM22在膠質瘤患者組織樣本和細胞系的表達情況Figure 1 Expression of TRIM22 in glioma tissues and cell lines

2.2 沉默TRIM22抑制膠質瘤細胞增殖

qRT-PCR和Western blotting結果表明,與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細胞中TRIM22的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01)。CCK-8比色法檢測細胞增殖結果表明,與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細胞的增殖顯著降低(P<0.05,見圖2)。

A.RT-PCR檢測TRIM22在U87細胞中的表達 B.Western blotting檢測TRIM22在U87細胞中的表達 C.CCK-8比色法測定U87細胞增殖情況1.Con-shRNA;2.shRNA-TRIM22;與Con-shRNA組相比,*P<0.05,**P<0.01圖2 沉默TRIM22抑制U87細胞增殖Figure 2 Silencing of TRIM22 inhibits the proliferation of U87 cells

2.3 沉默TRIM22抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲

與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.01,見圖3)。這表明,沉默TRIM22可顯著抑制U87細胞的遷移和侵襲。

A.Transwell法檢測U87細胞的遷移 (×100) B.Transwell法檢測U87細胞的侵襲 (×100)與Con-shRNA組相比,**P<0.01圖3 沉默TRIM22可抑制U87細胞的遷移和侵襲Figure 3 Silencing of TRIM22 inhibits migration and invasion of U87 cells

2.4 沉默TRIM22抑制膠質瘤細胞上皮-間充質轉化(EMT)過程

與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細胞的EMT過程標志蛋白E-cadherin的表達水平顯著升高,Vimentin蛋白表達水平顯著降低(P<0.01,見圖4)。

與Con-shRNA組相比,**P<0.01圖4 沉默TRIM22抑制了U87細胞中的EMT過程Figure 4 Silencing of TRIM22 inhibits EMT in U87 cells

2.5 沉默TRIM22抑制膠質瘤細胞Wnt/β-catenin通路的激活

Western blotting結果表明,與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細胞中cyclinD1和c-Myc蛋白的表達水平顯著降低(P<0.01);與shRNA-TRIM22組相比,shRNA-TRIM22+LiCl組U87細胞中cyclinD1和c-Myc蛋白的表達水平顯著提高(P<0.01,見圖5)。與Con-shRNA組相比,shRNA-TRIM22組U87細胞的增殖、遷移和侵襲受到顯著抑制;與shRNA-TRIM22組相比,shRNA-TRIM22+LiCl組U87細胞的增殖、遷移和侵襲能力均顯著升高(P<0.01,見圖6)。

1.Con-shRNA；2.shRNA-TRIM22；3.shRNA-TRIM22+LiCl；與Con-shRNA組相比,**P<0.01;與shRNA-TRIM22組相比,##P<0.01圖5 沉默TRIM22可抑制U87細胞Wnt/β-catenin通路的激活Figure 5 Silencing of TRIM22 inhibits the activation of Wnt/β-catenin pathway in U87 cells

與Con-shRNA組相比,**P<0.01;與shRNA-TRIM22組相比,##P<0.01圖6 沉默TRIM22對U87細胞遷移和侵襲的影響 (×100)Figure 6 The effect of silencing TRIM22 on the migration and invasion of U87 cells (×100)

3 討論

盡管目前有多種形式的療法,包括安全手術切除、放療和替莫唑胺化學療法,但對于多形膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)的臨床治療仍然收效甚微[9]。GBM患者的預后仍然很差,迫切需要尋找新的治療方法以取得更好的治療效果。文獻報道,TRIM家族是重要的癌變調節劑,它們參與了許多細胞的生物學行為,同時TRIM蛋白因具有E3泛素連接酶活性而受到廣泛關注[10,11]。

TRIM24,又稱轉錄中介因子1,在頭頸部鱗狀細胞癌和人宮頸癌中過表[12];TRIM27可促進結直腸癌和卵巢癌的發展[13]。TRIM蛋白參與維持細胞內部和外部環境所需的某些機制;但當它們的基因改變時,TRIM蛋白具有致癌潛力[10]。此外,一些TRIM蛋白通過調節p53在腫瘤的發生和發展中具有雙重作用[7]。因此,對TRIM蛋白的機制和參與腫瘤發生的進一步研究可能為癌癥治療提供有效的靶標。在這項研究中,我們發現TRIM22作為癌基因在高級別神經膠質瘤中過表達。

TRIM22是一種干擾素誘導蛋白,TRIM22最初被鑒定為一種干擾素誘導基因,并且還發現是TP53的轉錄靶基因[14]。TRIM22在大多數非小細胞肺癌組織中上調,并且與淋巴結轉移和TNM分期密切相關,TRIM22的過表達可能促進NSCLC的增殖和侵襲,提示了TRIM22作為癌基因的功能[15]。TRIM22抑制軟瓊脂中白血病U-937細胞的克隆生長,這表明TRIM22可能在白血病細胞增殖中發揮作用,并且TRIM22的水平升高與早幼粒細胞白血病細胞的誘導分化有關[16]。然而,仍有文獻報道,沉默TRIM22基因后,它可以抑制細胞的增殖,誘導細胞周期阻滯并導致細胞凋亡[17]。這些結果提示TRIM22在癌癥中可能具有雙重作用。

TRIM22的這種雙重作用可能歸因于器官特異性的作用和不同的細胞環境[18]。本研究表明TRIM22在膠質瘤組織和細胞系中表達上調。TRIM22基因被敲除后抑制了U87細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究的結果提示TRIM22在膠質瘤中可能是一個癌基因。因此,如果將TRIM22抑制劑作為膠質瘤治療藥物將具有重要意義。

在典型的Wnt信號通路途徑中,可通過Wnt蛋白與表面受體的結合而激活,從而抑制β-catenin的磷酸化和降解并調控c-Myc和cyclin D1等靶基因的轉錄[19]。Wnt信號轉導級聯是整個動物界發育的主要調節因子,Wnt也是成年哺乳動物中大多數類型的組織干細胞的關鍵驅動因素;對細胞的增殖、凋亡和侵襲等方面均有影響[20]。因此,抑制Wnt/β-catenin通路的激活可能成為膠質瘤治療的一種新的治療辦法。本研究的結果表明,沉默TRIM22抑制了Wnt/β-catenin通路相關蛋白的激活。此外,LiCl處理可減弱TRIM22對U87細胞的作用。

綜上所述,本研究的結果表明,TRIM22在膠質瘤組織和細胞系中表達顯著上調;體外研究表明,TRIM22基因敲除抑制了U87細胞的增殖、遷移和侵襲。此外,TRIM22還通過調節Wnt/β-catenin途徑發揮作用;這提示TRIM22在膠質瘤中可能是一個潛在的致癌基因。