納米氧化銅對藏雞肝臟TGF-β1表達的影響

常振宇，李家奎，2，董海龍，張笑冰，吳慶俠*

(1.西藏農(nóng)牧學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

銅元素是動物生命活動中必不可少的金屬元素之一，與機體的生長、繁殖、免疫、新陳代謝、造血、器官正常運行等生命活動有緊密的聯(lián)系[1-3]。納米技術(shù)是20世紀80年代末提出并快速發(fā)展起來的一種科學(xué)技術(shù)，納米微粒是指粒徑為1～100 nm的細小物質(zhì)微粒[4]。納米微量元素添加劑由于其比表面積大，所以其催化效率和表面反應(yīng)活性較高，吸附能力更強，近年來受到了廣泛的關(guān)注[5-6]。銅作為畜禽生長所必需的微量元素，是飼料添加劑中必不可少的原料，但高銅飼料的濫用，不僅對動物機體造成肝臟和腎臟等器官的直接損害，經(jīng)家禽糞便排出的銅還對生態(tài)環(huán)境造成巨大污染。目前國內(nèi)外關(guān)于納米氧化銅(nano-CuO)對動物機制研究還不成熟，迄今為止，納米飼料添加劑在藏雞體內(nèi)的吸收、代謝和生物學(xué)作用的研究報道較少。肝纖維化是由于多種致病因子所導(dǎo)致的肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生，任何肝臟損傷在肝臟修復(fù)愈合的過程中都有肝纖維化的產(chǎn)生，轉(zhuǎn)化生長因子β1( transforming growth factor-β1，TGF-β1) 在肝纖維化的啟動、進展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，與肝星形細胞向肌成纖維化細胞的轉(zhuǎn)化有著密切聯(lián)系[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)nano-CuO有利于促進動物生長[10]，但詳細的添加劑量還有待探討。本研究通過對比分析不同濃度梯度的nano-CuO對藏雞肝臟TGF-β1 mRNA、蛋白表達水平的影響以及肝臟的病理學(xué)變化，探討nano-CuO作為飼料添加劑在藏雞飼養(yǎng)中的安全添加劑量，為藏雞養(yǎng)殖中實際應(yīng)用nano-CuO飼料添加劑提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組選取西藏農(nóng)牧學(xué)院畜牧場的健康藏雞120羽，隨機分成4組，每組30羽，空白對照組藏雞飼喂無任何銅添加劑飼料，低、中、高劑量nano-CuO組藏雞分別飼喂5,50,100 mg/kg nano-CuO飼料，藏雞自由采食，于14日齡開始，連續(xù)飼喂不同劑量的nano-CuO，試驗期2周，于28日齡心臟采血 10 mL，1 000 r/min離心20 min，取上清液，-20℃保存，用于生化指標的檢測。采用空氣靜脈注射法處死藏雞，宰殺取肝臟組織，保存于液氮中。基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 藏雞基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平 %

1.2 主要儀器與試劑高速冷凍離心機(型號為3K15，Sigma)；萊卡組織切片機(型號為RM-2245)；光學(xué)顯微鏡(型號為CX41)；原子吸收分光光度計(型號為AA-6630C)；TGFβ抗體(武漢谷歌生物公司)；TBS濃縮緩沖液、中性樹膠、水楊酸甲酯、二甲苯、福爾馬林、PVDF 膜、顯影定影試劑、轉(zhuǎn)移緩沖液、電泳緩沖液等。

1.3 微量元素的測定稱取一定量的藏雞腎臟和肝臟樣品，65℃烘干，粉碎再次稱取1.0～2.0 g，烘干樣品置于馬弗爐中，250℃碳化至無煙后，650℃灼燒3 h，冷卻后加10 mL鹽酸和0.3 mL硝酸煮沸溶解，定容至50 mL容量瓶，用原子吸收分光光度計測定組織中銅、鐵、鋅的含量。

1.4 組織切片HE染色固定組織修整與水洗，分別將組織置于梯度酒精中進行脫水；將脫水后的組織浸在水楊酸甲酯中過夜處理；提前將蠟塊反復(fù)凍融后放置在65℃溫箱內(nèi)依次浸蠟，組織包埋，RM-2245組織切片機切片；將毛筆上的組織片用鑷子輕輕拉起，然后輕拖著鋪于40%酒精上預(yù)展，組織片基本無皺褶后用1個玻璃片輕輕撈起放入溫水中使其完全展開；用載玻片輕輕將組織片撈起，將載玻片45°傾斜放置，于烘片機上烘2 h；二甲苯、梯度酒精進行脫蠟，蘇木素、伊紅染液染色，脫水透明，中性樹膠滴在脫水好的載玻片組織上封片。將封好的切片用 Olympus 光學(xué)顯微鏡進行觀察并拍照，記錄結(jié)果。

1.5 免疫組化檢測TGF-β1藏雞肺動脈平滑肌組織經(jīng)包埋切片后，3% H2O2溶液避光室溫條件下作用30 min；修復(fù)緩沖液進行抗原修復(fù)，3% TBST 封閉，分別滴加兔抗鼠TGF-β 抗體(1∶100)、山羊抗兔 HRP- IgG為二抗，孵育，按說明書進行二氨基聯(lián)苯胺法顯色操作；蘇木素染液復(fù)染2 min，梯度酒精脫水、透明和封片(用 PBS緩沖液替代一抗作陰性對照)，應(yīng)用Olympus光學(xué)顯微鏡進行觀察并拍照。

1.6 實時熒光定量PCR檢測TGF-β1 mRNA水平表達提取藏雞肝組織 RNA，用核酸定量儀檢測 RNA的濃度和純度，所得 RNA 通過反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，-20℃保存。以 β-actin 為內(nèi)參基因，引物見表2，檢測 TGF-β1 mRNA 表達量。實時熒光定量 PCR 反應(yīng)體系 25 μL:2×qPCR Mix 12.5 μL，2.5 μm 內(nèi)標引物 2.0 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件:95℃ 1 min;95℃ 5 s，72℃ 20 s，72℃ 5 min，40個循環(huán)。用 LightCycler 96 進行熒光檢測，并用 2-ΔΔCt方法進行相對定量分析。

表2 引物信息

2 結(jié)果

2.1 不同劑量的nano-CuO對藏雞金屬沉積的影響由表3可知，在藏雞肝組織中銅含量隨著nano-CuO添加劑量的增加呈上升趨勢，其中100 mg/kg nano-CuO組增加最多，并顯著高于其他各組(P<0.01)，5,50 mg/kg nano-CuO組與對照組相比差異顯著(P<0.05)；肝組織中鐵含量隨著銅添加劑量的增加呈減少趨勢，且與對照組相比差異顯著(P<0.05)；肝組織中鋅含量受飼料中銅含量的影響較小，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)。在腎臟組織中銅含量隨著飼料中銅添加劑量的增加呈增加趨勢，5 mg/kg nano-CuO組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，50 mg/kg nano-CuO組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，100 mg/kg nano-CuO組與對照組之間差異極顯著(P<0.01)；腎臟組織中鐵含量隨著銅添加劑量的增加呈減少趨勢，除5 mg/kg nano-CuO組之外，其他兩組與對照組之間差異極顯著(P<0.01)；50 mg/kg nano-CuO組相對對照組降低較少(P<0.05)。腎臟組織中鋅含量受飼料中銅含量影響不大，各組與對照組之間差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同劑量的銅對藏雞肝臟、腎臟中銅、鐵、鋅活性的影響 mg/kg

2.2 不同劑量的nano-CuO對藏雞血清中銅、鐵、鋅含量的影響由表4可知，藏雞血清中銅含量隨著銅添加劑量的增加呈現(xiàn)增加的趨勢，其中100 mg/kg nano-CuO組比對照組有顯著的增加(P<0.01)，但是除100 mg/kg nano-CuO組外，其余各組與對照組沒有顯著性差異(P>0.05)；血清中鐵含量隨著銅添加劑量的增加也呈現(xiàn)增加的趨勢，5 mg/kg nano-CuO組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，50 mg/kg nano-CuO組與對照組相比差異顯著(P<0.05)，100 mg/kg nano-CuO組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)；血清中鋅含量隨著銅添加劑量的增加逐漸減少，5，50 mg/kg nano-CuO組與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，100 mg/kg nano-CuO組比對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

表4 不同形式和劑量的銅對藏雞血清中銅、鐵、鋅含量的影響 mg/L

2.3 HE染色組織觀察結(jié)果通過HE染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，與正常對照組藏雞肝臟(圖1A)相比，5 mg/kg nano-CuO組藏雞肝臟肝小葉輪廓清晰，無病變出現(xiàn)(圖1B)；50 mg/kg nano-CuO組藏雞肝細胞有輕微水泡變性和顆粒變性，并有血細胞滲出(圖1C)；100 mg/kg nano-CuO組以顆粒變性為主，水泡變性較50 mg/kg nano-CuO組更嚴重，中央靜脈擴張(圖1D)。

A.對照組肝臟;B.5 mg/kg nano-CuO組肝小葉輪廓清晰;C.50 mg/kg nano-CuO組肝細胞輕微水泡變性;D.100 mg/kg nano-CuO組顆粒變性為主，水泡變性更加嚴重,中央靜脈擴張。①輕微水泡變性;②中央靜脈擴張;③顆粒變性;④水泡變性

2.4 TGF-β1免疫組化結(jié)果免疫組化結(jié)果表明，100 mg/kg nano-CuO組藏雞肝組織表現(xiàn)出明顯的棕黃色、黃色，陽性表達強烈(圖2A)，空白對照組和5,50 mg/kg nano-CuO組藏雞肝組織有弱陽性反應(yīng)，顏色較淺(圖2B～D)。陰性對照組(不加一抗)，則無陽性反應(yīng)顯色(圖2E)。

A.100 mg/kg nano-CuO組；B.空白對照組；C.5 mg/kg nano-CuO組；D.50 mg/kg nano-CuO組；E.陰性對照組

2.5 RT-qPCR方法檢測肝組織 TGF-β1 mRNA水平由圖3可見，與對照組相比，5，50 mg/kg nano-CuO組藏雞肝臟 TGF-β1 mRNA 水平未發(fā)生明顯變化(P>0.05)，100 mg/kg nano-CuO組藏雞肝臟 TGF-β1 mRNA 水平顯著升高(P<0.01)。

圖3 藏雞肝臟組織中TGF-β1 mRNA表達水平檢測

3 討論

本試驗通過檢測肝臟、腎臟及血清中銅、鐵、鋅含量發(fā)現(xiàn)，nano-CuO組隨著銅添加劑量的增加，肝臟、腎臟和血清組織中銅的含量逐漸增加，結(jié)果與有關(guān)報道相一致[11-14]。何欣等[15]發(fā)現(xiàn)肝臟作為動物體內(nèi)重要的儲銅庫，肝臟中銅含量的水平直接受到日糧銅水平的影響。同時張?zhí)K江等[16]發(fā)現(xiàn)肝臟中銅含量的變化與血清中銅濃度的變化呈正比。本試驗發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，5 mg/kg nano-CuO組中腎臟的銅含量變化不明顯。另外，大多數(shù)組織中銅含量與鐵、鋅含量呈負相關(guān)，肝臟中表現(xiàn)最為明顯。出現(xiàn)這種情況的原因是：動物體內(nèi)銅、鐵、鋅的代謝具有密切的關(guān)系，吸收的銅主要以銅藍蛋白的形式轉(zhuǎn)運到各組織器官，試驗中隨日糧銅濃度增加，血中鐵的濃度增加，由于銅藍蛋白能提高鐵的代謝和轉(zhuǎn)運，血中銅藍蛋白濃度的增加使血鐵的含量也增加。同時，由于銅、鐵、鋅元素之間存在一定的拮抗作用，高銅飼糧對組織中鐵、鋅含量有一定的影響。銅阻礙了鐵、鋅在動物體內(nèi)的吸收和存積，導(dǎo)致組織中鐵含量的降低，其拮抗機制有研究表明[17-19]，銅只有與其轉(zhuǎn)運的相關(guān)蛋白質(zhì)相結(jié)合后才能被吸收，而銅離子有相同或相似的轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合位點，由于競爭關(guān)系從而導(dǎo)致銅的吸收與鐵、鋅的吸收呈負相關(guān)。

組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加50 mg/kg的nano-CuO時，肝組織出現(xiàn)有輕微的水泡變性和顆粒變性，但組織結(jié)構(gòu)清晰。隨著日糧中銅添加水平的增加，細胞出現(xiàn)嚴重的顆?；蛩葑冃?，當飼料中nano-CuO含量達到100 mg/kg時，可導(dǎo)致藏雞肝組織發(fā)生明顯的病理學(xué)變化，細胞結(jié)構(gòu)開始消失，特別是在100 mg/kg nano-CuO組肝小葉的中央靜脈已經(jīng)發(fā)生了擴張。出現(xiàn)這種情況，說明nano-CuO更容易進入肝組織形成沉積，從而導(dǎo)致其組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

研究表明，TGF-β1 屬于TGF-β超家族，是目前公認的致纖維化的最強細胞因子，細胞的免疫功能、分化和生長都與之調(diào)節(jié)有關(guān)[20]。當肝臟受到損傷時，竇內(nèi)皮細胞、肝枯否細胞以及壞死的肝細胞等通過旁分泌或自分泌方式生成TGF-β1。本試驗發(fā)現(xiàn)，5,50 mg/kg nano-CuO組藏雞肝組織 TGF-β1含量無明顯變化，100 mg/kg nano-CuO組藏雞肝組織TGF-β1表達顯著升高。由此說明，當飼料中nano-CuO劑量超過100 mg/kg時，會對藏雞機體造成直接損害，飼料中nano-CuO添加劑質(zhì)量濃度應(yīng)控制在5～50 mg/kg。