前列腺素E2介導由金黃色葡萄球菌引起的奶牛子宮內膜組織損傷

劉 昆，曹金山，劉 博，丁玉玲，裴 樂，毛 偉*

(1.內蒙古農業大學 獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031)

哺乳動物子宮在產后或交配的過程中易受到細菌的感染而導致不孕癥或慢性子宮內膜炎。細菌感染產后奶牛子宮時，約20%的奶牛患子宮內膜炎，嚴重影響奶牛的產奶量與再孕率[1-2]。臨床上常用于治療奶牛子宮內膜炎的方法主要通過抗生素治療，但無法提高該類疾病的治愈率和患病奶牛的再孕率[3]。

哺乳動物子宮微環境穩態對胚胎的正常發育至關重要，同時該穩態的維持與子宮內膜疾病的發生及患病后的用藥治療效果直接相關[4-6]。據報導，前列腺素E2(PGE2)可通過調控結締組織生長因子及具有血管再生作用的IL-8的表達，在人子宮內膜修復過程中發揮著重要作用[7]。PGE2由花生四烯酸經一系列酶的催化作用產生，催化產生的酶類物質，除磷脂酶外還包括環氧合酶-1(cyclooxygenase-1，COX-1)和環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)。有研究指出,在奶牛發生子宮內膜炎的過程中，COX-2的mRNA表達量顯著高于健康奶牛[8];另外，PECCHI等[9]提出PGE2是前列腺素類化合物中與各種炎癥性疾病關聯最密切的一種前列腺素，這表明PGE2不僅可修復子宮內膜而且與子宮內膜炎的炎癥過程相關，而且細菌感染很大程度上誘導了奶牛子宮內膜中PGE2的合成[10]。

常見的感染奶牛子宮內膜的細菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與一些厭氧型細菌[11]。在細菌性子宮內膜炎中，奶牛子宮內膜受到細菌感染后引起炎癥反應，細菌及細菌毒素誘導上皮細胞和基質細胞產生促炎性細胞因子與趨化因子。同時，受損或死亡的細胞所釋放的內源性分子通過激活免疫細胞，引起免疫應答，這一類內源性分子被稱為損傷相關因子。高遷移率蛋白(high-mobility grope box protein 1，HMGB-1)與透明質酸(hyaluronidase，HA)可作為多種炎癥過程中的損傷相關因子。HMGB-1是一種重要的細胞內調節因子，參與細胞內DNA的轉錄、重組、翻譯和修飾[12]。HMGB-1的釋放與壞死細胞相關，該過程可簡要描述為壞死的細胞釋放的染色質被遞呈細胞上的膜受體識別后釋放到細胞外[13],說明HMGB-1與組織損傷相關。透明質酸酶廣泛分布于多種組織及細胞內，在發生炎癥的過程中，透明質酸酶由聚合的大分子物質，分解為小分子物質，并且分解的小分子物質常與其他蛋白相結合，形成透明質酸酶結合蛋白(hyaluronidase binding protein,HABP)，其中，形成的透明質酸酶結合蛋白1(hyaluronidase binding protein-1,HABP-1)與炎癥反應密切相關[14]。

本試驗以體外培養的奶牛子宮內膜組織作為研究對象，經熱滅活金黃色葡萄球菌刺激，與COX-2抑制劑共孵育，通過ELISA、q-PCR、Western blot、免疫熒光及病理切片觀察，檢測內源性PGE2在降低后，金黃色葡萄球菌所引起的奶牛子宮內膜組織損傷因子HMGB-1與HABP-1表達水平及其組織的損傷是否發生變化。旨在通過闡述PGE2對細菌所引起的奶牛子宮內膜組織損傷的調控作用，為臨床中合理使用前列腺素類藥物治療細菌性子宮內膜炎而導致的不孕癥，繼而提高奶牛繁殖能力提供新的疾病防制學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料本試驗使用的金黃色葡萄球菌為內蒙古地區奶牛子宮內膜炎臨床分離株,由內蒙古農業大學藥理實驗室保存(鑒定證書編號：SYS110018)；Mueller-Hinton(M-H)肉湯培養基(OXOID，England);COX-2抑制劑NS-398、CAY10404(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI);DMEM/F-12培養基(Gibco，China);青鏈霉素(Gibco，China);兩性霉素B(Generay,China);Western blot試驗所用一抗HABP-1、HMGB-1(Abbexa,UK),二抗山羊抗兔IgG抗體(Abcam,USA);RNA提取試劑盒(Axygen Scientific,USA);PGE2ELISA檢測試劑盒(Cayman,Ann Arbor,MI);反轉錄試劑Primer ScriptRTMaster Mix(TaKaRa,Japan);SYBR Green Master(Rox,Germany);引物由Invitrogen公司合成。

1.2 奶牛子宮內膜組織的體外培養方法參照文獻[7]方法與內蒙古農業大學藥理實驗室建立的優化培養條件，培養方法：取健康奶牛子宮角，置于含5%青鏈霉素、2%兩性霉素的PBS中，4℃處理30 min。在無菌的環境下縱向剪開奶牛子宮角，暴露子宮內膜后，將奶牛子宮內膜剪成條索狀并置于含2%青鏈霉素、1%兩性霉素的PBS中4℃處理20 min，并重復此步驟。將處理后的奶牛子宮內膜組織剪成直徑約2 mm，厚度約1 mm的塊狀組織，放入到含2%青鏈霉素、5%胎牛血清的DMEM/F12培養基中在37℃、5%CO2條件下進行培養，每24 h更換1次培養液。

1.3 金黃色葡萄球菌的培養與熱滅活金黃色葡萄球菌的制備使用M-H培養基對金黃色葡萄球菌進行培養。根據細菌生長時培養基D600 nm值的不同，繪制金黃色葡萄球菌的生長曲線，以確定金黃色葡萄球菌達到生長對數期的時間。將達到生長對數期的金黃色葡萄球菌5 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，使用無菌PBS重懸浮后置于85℃水浴中，處理30 min。

1.4 熱滅活金黃色葡萄球菌體外刺激奶牛子宮內膜組織與抑制劑的處理方法培養奶牛子宮內膜組織后3 d，將含5%胎牛血清與青鏈霉素的DMEM/F12培養基，更換為DMEM/F12培養基，饑餓處理后8 h，再將培養基更換為僅含5%胎牛血清的DMEM/F12培養基。在培養基中分別加入無菌PBS，1×108CFU/mL熱滅活的金黃色葡萄球菌處理8 h。在培養基中加入濃度均為1×10-7MNS-398、CAY10404處理15 min后，加入1×108CFU/mL熱滅活金黃色葡萄球菌，37℃、5%CO2條件下培養8 h后收集奶牛子宮內膜組織與培養基上清液。

1.5 奶牛子宮內膜組織RNA提取及反轉錄使用Axgeny RNA提取試劑盒提取不同處理組的奶牛子宮內膜組織中RNA(具體步驟見說明書)，并檢測提取的RNA濃度。將所有RNA樣品均稀釋至終質量濃度為100 mg/L。使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，反轉錄體系：ddH2O 5 μL,cDNA 3 μL，5×Primer Mix 2 μL。反轉錄條件：37℃ 15 min,85℃ 5 s。

1.6 熒光定量PCR反應熒光定量PCR反應體系：SYBR GreenMix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各0.75 μL，模板2.5 μL，總體積25 μL。反應條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s,60℃ 30 s,40個循環。引物信息如表1所示。

表1 引物信息

1.7 Western blot檢測研磨奶牛子宮內膜組織，置于1.5 mL離心管中，加入組織裂解液與磁珠后，在磁珠研磨機中裂解3 min，冰上靜置5 min后，14 000 r/min 離心10 min，收集上清液，測定所提取蛋白的濃度，并與5×蛋白緩沖液進行混合。電泳：配制12% SDS-PAGE膠，每孔蛋白質量為20 μg。以80 V電壓，恒壓電泳至條帶到膠的末端后停止電泳。切下蛋白大小為31,42,23 kDa附近的SDS-PAGE膠。轉膜：按照正極—電轉海綿—濾紙—PVDF膜—SDS-PAGE膠—濾紙—電轉海綿—負極的順序裝配，調整轉膜儀電壓至25 V，轉膜時間為90 min。封閉：取出PVDF膜放入到5%脫脂乳中室溫孵育2 h。一抗孵育：按照β-actin 1∶3 000,HABP-1、HMGB-1為1∶1 000的比例進行稀釋，與電轉后的PVDF膜在4℃條件下過夜孵育。二抗孵育：取出PVDF膜，使用TBST潤洗10 min，潤洗3次后在室溫環境下孵育二抗1 h。成像：使用TBST潤洗 5 min，潤洗4次后置于成像儀中，加入ECL顯色液后，根據PVDF膜上的條帶清晰程度調整曝光時間。

1.8 奶牛子宮內膜組織中PGE2ELISA試驗收集體外培養的奶牛子宮內膜組織的上清液，以10 000 r/min 離心10 min后收集上清液，使用PBS稀釋20倍，用以檢測奶牛子宮內膜組織分泌到培養液中PGE2的含量。

1.9 HE染色將不同處理組的奶牛子宮內膜組織，置于梯度酒精中進行脫水處理(酒精濃度為：100%,95%,80%,75%,50%)，置于石蠟中包埋，并制作切片，使用蘇木精、伊紅染色液對石蠟切片進行染色，在光學顯微鏡下(40×)觀察組織病理變化，拍照記錄。

1.10 免疫熒光染色試驗將奶牛子宮內膜組織制作成冰凍切片，經冷丙酮固定后，加入3%過氧化氫溶液處理5 min以去除非特異性結合。使用TBST潤洗3次，每次10 min。封閉：將冰凍切片置于含5%牛血清白蛋白中室溫封閉2 h；一抗孵育；將HABP-1與HMGB-1一抗按照1∶200進行稀釋后與冰凍切片在4℃條件下過夜孵育;二抗孵育：取出冰凍切片，使用TBST潤洗10 min，潤洗3次后加入熒光二抗，置于暗盒中，室溫孵育1 h；成像：TBST潤洗5 min，潤洗4次后，使用激光共聚焦顯微鏡成像。

2 結果

2.1 PGE2的分泌水平檢測結果為驗證熱滅活金黃色葡萄球菌是否可誘導PGE2的蓄積，以及本試驗所使用的COX-2抑制劑是否可降低由熱滅活金黃色葡萄球菌所上調的PGE2的分泌量。在體外培養的奶牛子宮內膜組織培養液中分別加入PBS(control，空白對照組)、熱滅活的金黃色葡萄球菌(HK-S.aureus)、熱滅活金黃色葡萄球菌與COX-2抑制劑(CAY10404、NS-398)共孵育8 h后收集上清液，ELISA檢測PGE2分泌量。結果如圖1所示，加入熱滅活金黃色葡萄球菌后，PGE2蓄積量顯著高于空白對照組(P<0.05),而與CAY-10404與NS-398共孵育后，PGE2表達量較熱滅活金黃色葡萄球菌處理組顯著降低(P<0.05)，說明本試驗使用的COX-2抑制劑可降低由熱滅活金黃色葡萄球菌所上調的PGE2的分泌量，該濃度的抑制劑可用于后續試驗。

2.2 HMGB-1、HABP-1 mRNA與蛋白的表達量檢測結果本試驗通過檢測損傷相關因子HMGB-1、HABP-1的表達水平，以證明PGE2在體外是否可介導由金黃色葡萄球菌所引起的奶牛子宮內膜組織的損傷。HMGB-1、HABP-1 mRNA與蛋白表達水平如圖2所示，僅加入COX-2抑制劑(CAY-10404與NS-398)時，HMGB-1與HABP-1 mRNA表達量與空白對照組無顯著性差異(P>0.05)，說明該濃度下的抑制劑對培養的奶牛子宮內膜組織無影響，可用于后續的試驗。加入熱滅活金黃色葡萄球菌處理后，HMGB-1、HABP-1 mRNA與蛋白表達量與空白對照組比較顯著上升(P<0.05)，而熱滅活金黃色葡萄球菌與CAY-10404、NS-398共孵育后，HMGB-1(圖2A,C)與HABP-1(圖2B,D) mRNA與蛋白表達量與熱滅活金黃色葡萄球菌處理組相比，顯著下降(P<0.05)，說明PGE2在體外可介導由金黃色葡萄球菌所引起的奶牛子宮內膜組織的損傷。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。下同

圖2 HMGB-1(A,C)和HABP-1(B,D)表達量

2.3 HMGB-1、HABP-1免疫熒光檢測結果進一步檢測HMGB-1、HABP-1的表達水平，使用免疫熒光的方法檢測HMGB-1(圖3A～D) 及HABP-1(圖3E～H) 在奶牛子宮內膜組織中的熒光強度。檢測結果顯示，收集不同處理組的奶牛子宮內膜組織，分別加入PBS處理(圖3A,E)、熱滅活金黃色葡萄球菌(圖3B,F)、熱滅活金黃色葡萄球菌與CAY-10404(圖3C,G)、熱滅活金黃色葡萄球菌與NS-398(圖3D,H)。結果顯示:加入熱滅活金黃色葡萄球菌后HMGB-1與HABP-1熒光強度上升(P<0.05)，而加入CAY-10404與NS-398及HMGB-1(圖3I)與HABP-1(圖3J)后熒光強度顯著下降(P<0.05)。

圖3 HMGB-1(A～D,I)與HABP-1(E～H,J)免疫熒光檢測結果

2.4 HE染色結果為驗證損傷相關因子的表達水平，是否與奶牛子宮內膜組織的損傷程度相一致。本試驗使用HE染色方法，觀察組織的實際損傷程度。不同處理組的奶牛子宮內膜組織HE如圖4所示，對照組(圖4A)奶牛子宮內膜組織腺上皮細胞完整，且完整排列于腺體周圍，加入熱滅活金黃色葡萄球菌后(圖4B)，腺上皮細胞發生皺縮，而與CAY-10404(圖4C)與NS-398(圖4D)共孵育后，腺上皮細胞皺縮程度降低。

3 討論

細菌性奶牛子宮內膜炎多發于產后1～4周奶牛，其發病機理及炎癥過程中的調控過程尚不清楚[10,16-17]。PGE2是前列腺素類化合物中與炎癥反應最密切的，在奶牛患子宮內膜炎時，COX-2與mPGES-1 mRNA的表達量均顯著高于健康奶牛[7,10]，并且與一些促炎性細胞因子呈正相關關系，這提示PGE2參與奶牛子宮內膜炎。

本試驗使用2種COX-2抑制劑：CAY10404和NS-398，結果顯示COX-2抑制劑可顯著降低損傷相關因子HMGB-1與HABP-1的mRNA和蛋白的表達量。HE染色結果顯示，金黃色葡萄球菌損傷奶牛子宮內膜腺上皮細胞。研究表示，奶牛子宮內膜腺上皮細胞除分泌功能外，還充當著由胚體傳遞信號給母體的介質作用，這種作用與維持胚胎的穩定相關[16]。金黃色葡萄球菌可損傷腺上皮細胞，這可能與細菌性子宮內膜炎導致的產后不孕相關，金黃色葡萄球菌在奶牛子宮內膜炎中常被認為是亞臨床型感染細菌，而不受到關注。本試驗結果表明，金黃色葡萄球菌可引起較為嚴重的子宮腺上皮損傷，因此在治療時，必須予以重視。COX-2抑制劑可顯著抑制金黃色葡萄球菌對奶牛子宮內膜腺體上皮細胞的損傷，并與損傷相關因子檢測結果相一致，說明PGE2可調控奶牛子宮內膜組織中損傷相關因子的表達。

我國奶牛存欄量已達1 400余萬頭[16]，已成為我國養殖業的主要組成部分之一。在奶牛養殖生產工作中，造成奶牛淘汰的主要原因之一是生殖系統疾病。以內蒙古自治區為例，因奶牛生殖系統疾病所導致的延期受孕、不孕或治療成本過高等而淘汰造成的經濟損失每年約達10億元，在獸醫臨床上雖然常用前列腺素類藥物和非甾體類抗炎藥治療生殖系統疾病，但僅靠獸醫工作者的經驗用藥，難以獲得理想的用藥效果，缺乏系統的理論指導和基礎理論的支持。如何提高奶牛的生產性能和母牛的受胎率，顯著提高牧場的經濟效益，提高奶牛繁殖障礙疾病的治愈率是亟待解決的問題。同時，闡明生殖內分泌的關鍵活性物質的種類及其作用機制和生殖道疾病的發病機理，才能從根本上解決通過臨床上有效提高奶牛繁殖能力的問題。本試驗證明HABP-1與HMGB-1同樣可作為奶牛子宮內膜炎的損傷相關因子，且受到PGE2的調控，表明PGE2調控細菌性子宮內膜組織的損傷，這對科學治療奶牛生殖系統疾病和提高奶牛的繁殖能力具有現實意義。

總之，金黃色葡萄球菌可造成奶牛子宮內膜組織嚴重損傷，損傷相關因子HMGB-1，HABP-1與奶牛子宮內膜組織損傷程度呈正相關關系，PGE2可誘導金黃色葡萄球菌所造成的奶牛子宮內膜組織損傷。