急性冷應激對斷奶仔豬全血中HSP70/TLR4/NF-κB通路的影響

陳 妍，徐 彬，劉 鵬，袁建彬，連 帥，計 紅，柳巨雄，楊煥民*

(1.黑龍江八一農墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319；2.吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

斷奶仔豬(30日齡)消化系統尚未發育完全，由依靠母乳生長轉變為采食飼料生長，很容易損害消化器官，造成營養不良。其次仔豬從育仔舍轉到常規舍，濕度、溫度、光照、氣體、噪音等環境因素發生改變[1]。這些外源性應激源都會對仔豬免疫系統和生理穩態造成破壞。冷應激是我國寒冷地區危害極大的一種應激性致病因素，冷應激會使動物機體對外源性和內源性致病因子的抵抗力下降，極易感染疾病，嚴重情況下會影響動物存活，導致畜牧業經濟損失。

熱休克蛋白70(HSP70)在正常情況下穩定表達于動物細胞中，在溫度沖擊或其他應激刺激下，大量合成，可保護機體免受細胞內蛋白變性或死亡[2]。近年有研究表明，HSP70不僅具有分子伴侶[3]和應激保護的功能，細胞表面和細胞外過度表達的HSP70有可能成為“危險信號”啟動先天性免疫反應[4]。Toll樣受體(TLRs)是近年來在免疫活性細胞上發現的表達豐富的病原模式識別受體[5]，Toll樣受體4(TLR4)是TLRs家族重要一員，可接受外源性或內源性配體的刺激，從而激活下游信號分子，同時釋放一系列炎性因子而引起炎癥反應。HSP70已被證明可作為TLR4內源性激活劑[6]。髓樣分化因子88(MyD88)在TLR4介導的通路中發揮銜接子的作用[7]，誘導一系列細胞內信號轉導，啟動活化核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路。NF-κB是一種控制一系列炎性因子基因表達的轉錄調節因子，TLR4信號中NF-κB最常激活的形式是由RelA(p65)和p50組成的異二聚體，RelA-p50異二聚體作為一種潛在的及不活躍的形式，通過與未受刺激細胞中的IkB蛋白相互作用而保存在細胞質中。無活性的p65被上游信號分子激活后，快速磷酸化并進入細胞核，負責TLR4介導的炎性因子的誘導，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-6(IL-6)等[8]。鑒于HSP70/TLR4/NF-κB通路在抗細菌或病毒免疫和炎性過程中的重要作用，我們推測其可能參與了冷應激條件下斷奶仔豬的免疫調節過程。本試驗采用qRT-PCR方法檢測冷應激不同時間后斷奶仔豬全血中HSP70/TLR4/NF-κB通路關鍵分子的表達變化，探討是否可以把HSP70/TLR4/NF-κB通路關鍵分子作為斷奶仔豬遭受冷應激程度的評價指標，進而為系統揭示冷應激發生時斷奶仔豬的炎癥反應的發生機制及防控技術的開發奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取體況相近健康斷奶仔豬(30日齡)16頭，在人工氣候室適應性喂養7 d后，隨機分為4組：常溫對照組、冷應激2，6,12 h組，每組4頭。冷應激溫度選取為(4±2)℃，正常飼養溫度選取為(24±2)℃，相對濕度均為40%～50%。預飼后1 d，22:00將冷應激12 h組仔豬放入人工冷應激氣候室，進行冷應激。2 d，6:00 將冷應激6 h組仔豬放入冷應激人工氣候室，進行冷應激；12:00將冷應激2 h組仔豬放入冷應激人工氣候室，進行冷應激。分別在第2天8:00、10:00、12:00、14:00采集常溫對照組、冷應激12，6，2 h組斷奶仔豬的全血樣品，-80℃保存。

1.2 引物設計和合成應用NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對豬HSP70、MyD88、TLR4、p65、IL-6、白介素-10(IL-10)的mRNA序列進行查詢，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行引物設計和合成，引物序列見表1。

表1 引物信息

1.3 全血中總RNA提取從-80℃超低溫冰箱中取出0.5 mL全血溶化后，加入1.5 mL紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解1～2 min；4℃、12 000 r/min離心5 min，吸取上層水相轉移到新的RNAfree EP管中，加入0.2 mL氯仿，吹打混勻后，室溫靜置15 min；4℃、12 000 r/min離心15 min，將上層水相吸取轉移到新的RNAfree EP管中，在冰上進行所有操作。向EP管中加入0.5 mL異丙醇，充分混勻，放置10 min后，4℃、12 000 r/min離心10 min；棄上層水相，加入1 mL 75%乙醇，充分吹打沉淀，4℃、7 500 r/min離心5 min；棄上層水相，使EP管內液體除盡，加入20 μL DEPC處理水吹吸沉淀。取1 μL RNA樣品，直接滴加在核酸蛋白測定儀上測定其濃度和D值。

1.4 cDNA的合成以全血中提取的總RNA作為模板，反轉錄過程應用Roche反轉錄試劑盒進行，試驗步驟：首先按照表2的試劑順序加入試劑，65℃加熱200 μL EP管10 min使模板-引物混合物變性，確保RNA二級結構變性，然后立即將EP管置于冰上冷卻。再按照表3的試劑順序加入試劑，25℃ 10 min，之后55℃ 30 min，再加熱至85℃維持5 min 使逆轉錄酶失活，將EP管立即置于冰上冷卻以停止反應。

表2 模板-引物結合反應體系

表3 反轉錄反應體系

1.5 qRT-PCR采用qRT-PCR技術檢測斷奶仔豬全血HSP70/TLR4/NF-κB通路關鍵分子水平的表達。應用Bio-Rad CFX96型熒光定量PCR儀進行檢測，具體按照用戶操作手冊在冰上避光進行。反應試劑：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL、RT reaction solution(cDNA) 2.0 μL、PCR Reverse Primer 1.0 μL、PCR Forward Primer 1.0 μL、dH2O 8.5 μL。循環參數：95℃ 35 s，60℃ 30 s，共39個循環。然后繼續在65～95℃的溫度區間內進行建立熔解曲線的反應，以0.5℃為循環梯度，每個循環5 s，共60個循環。將cDNA作為未知樣本，以GAPDH作為內參，每管設置3個重復，反應結束后得出每個樣本的Cq值，計算出相應的2-ΔΔCq值，用校正后的值判定相對表達量的差異。

2 結果

2.1 斷奶仔豬全血中HSP70水平變化采用qRT-PCR方法檢測斷奶仔豬全血中HSP70水平,如圖1所示，與常溫對照組相比，急性冷應激后各時間點斷奶仔豬全血中HSP70水平均升高，整體呈現先升高后降低的趨勢，其中冷應激2，6 h組極顯著高于常溫對照組(P<0.01)，冷應激6 h組達到峰值，冷應激12 h組與常溫對照組相比無顯著性變化。

*表示與常溫對照組相比差異顯著(P<0.05)，***表示與常溫對照組相比差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 斷奶仔豬全血中TLR4水平變化采用qRT-PCR方法檢測斷奶仔豬全血中TLR4水平,結果如圖2所示，與常溫對照組相比，急性冷應激后各時間點仔豬全血中TLR4水平均升高，整體呈現先升高后降低的趨勢，冷應激2 h組顯著高于常溫對照組(P<0.05)，冷應激6 h組極顯著高于常溫對照組(P<0.01)，冷應激6 h組達到峰值，冷應激12 h組與常溫對照組相比無顯著性變化。

圖2 急性冷應激后斷奶仔豬全血中TLR4水平變化

2.3 斷奶仔豬全血中MyD88和p65水平變化采用qRT-PCR方法檢測TLR4信號通路下游關鍵信號分子MyD88和p65在仔豬全血中的水平變化，結果如圖3所示，與常溫對照組相比，急性冷應激后各時間點仔豬全血中MyD88和p65的水平均呈現先降低后升高的趨勢，MyD88和p65的水平在冷應激2，6 h組極顯著低于常溫對照組(P<0.01)，而冷應激12 h組極顯著高于常溫對照組(P<0.01)。

圖3 急性冷應激后斷奶仔豬全血中MyD88和p65水平變化

2.4 斷奶仔豬全血中炎性因子水平變化采用qRT-PCR方法檢測斷奶仔豬全血中促炎因子TNF-α和IL-6和抗炎因子IL-10水平變化，結果如圖4所示，與常溫對照組相比，急性冷應激后促炎因子TNF-α和IL-6的水平均呈現先升高后降低的趨勢，且都在冷應激后6 h呈現暴發式增長，其中IL-6在冷應激2 h組顯著高于對照組(P<0.05)，TNF-α在冷應激2，12 h組以及IL-6在冷應激12 h組與常溫對照組相比無明顯變化。抗炎因子IL-10的水平呈現先降低后升高的趨勢，在冷應激6 h組極顯著降低(P<0.01)，在冷應激12 h組略升高，但仍顯著低于常溫對照組(P<0.01)。

A.TNF-α水平變化;B.IL-6水平變化;C.IL-10水平變化

3 討論

冷應激是寒冷地區最普遍存在的應激源，先天性免疫的激活和炎癥因子的級聯效應是應對冷應激的重要機制之一[9-11]。冷應激的主要特點之一就是高度誘導合成熱休克蛋白(HSPs)。HSPs是指在機體遭受冷應激及其他一些環境應激，如濕熱環境、電磁輻射、有毒氣體、噪音等有害刺激后，快速合成，并在不利環境下積極發揮對機體和細胞起保護作用的一類具有高度保守性的蛋白質[12]。HSP70是約為70 kDa的熱休克蛋白，是HSPs家族中標志性成員[13]。BHARATI等[14]研究表明，HSP70可能參與了塔卡帕克牛的熱應激適應性反應，其典型的雙相表達模式有助于保護動物免受熱應激，可作為塔帕卡牛慢性熱應激的重要生物標記。本試驗中，在冷應激2，6 h時，HSP70的水平顯著升高，說明機體對冷應激的響應增強，有利于機體自身及時啟動保護程序來抵抗冷應激。隨著應激時間的增加，HSP70水平開始下降，在冷應激12 h時，HSP70水平與常溫對照組相比無明顯變化。推測隨著冷應激時間增加，HSP70已無法抵抗冷應激來保護機體。

先天性免疫是宿主抵抗感染和惡性轉化的最初防線，對適應性免疫的建立具有深遠的影響。TLRs是機體內檢測多種微生物成分并激發先天性免疫反應的主要傳感器[15]。近年來研究表明，HSP70承擔著分子伴侶和保護機體免受應激損害的功能，當HSP70高度表達時，可作為TLR4的內源性配體[16]。ZHANG等[17]發現高氧后野生型小鼠肺和肺內皮細胞(MLEC)內所分泌的HSP70水平明顯升高，隨后證實HSP70和TLR4在肺組織和MLEC中免疫共沉淀，HSP70的細胞保護功能取決于TLR4。本試驗檢測了不同冷應激時間下TLR4的水平，發現TLR4與HSP70有相同的變化趨勢，即在冷應激6 h組顯著升高，在冷應激12 h組顯著降低，進一步證明TLR4被HSP70所激活。

TLR4識別病原體相關分子模式(PAMPs)后，通過其Toll/IL-1受體(TIR)結構域的親和力相互作用招募一組具有TIR結構域的銜接蛋白MyD88，這種信號級聯反應引起NF-κB的激活，導致隨后激活炎癥因子的基因被激活，例如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和趨化因子等[18]。一項研究表明，顱腦損傷后，姜黃素可通過激活小膠質細胞/巨噬細胞中TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的機制來減少小膠質細胞/巨噬細胞的急性激活和神經元凋亡，從而改善患者的預后[19]。本試驗中，在冷應激6 h時，MyD88和NF-κB p65水平顯著降低，促炎因子TNF-α、IL-6極顯著升高，抗炎因子IL-10極顯著降低，這一結果表明，在冷應激條件下，TLR4響應HSP70的過度表達被迅速激活，隨后下游的信號傳遞分子MyD88迅速增加進行信號轉導，最終導致核轉錄因子NF-κB被激活，促炎因子的產生和釋放以及抗炎因子的抑制。而隨著冷應激時間的增加，在冷應激12 h時，MyD88和NF-κB p65水平顯著升高，促炎細胞因子TNF-α、IL-6顯著降低，抗炎因子IL-10顯著升高，表明此時仔豬機體免疫系統已遭到破壞不足以抵抗冷應激。

綜上所述，急性冷應激會導致斷奶仔豬全血中HSP70/TLR4/NF-κB通路被激活，引起免疫反應，而隨著冷應激時間的增加，免疫功能會下降。可以考慮把HSP70/TLR4/NF-κB通路關鍵分子作為評價斷奶仔豬遭受冷應激程度的客觀指標，將有助于解決寒冷地區幼畜抗感染能力差、易患病等現實問題。