埃里希氏體病和萊姆病雙重熒光定量PCR診斷方法的建立

常 瑾，高 超，于喜冰，李俊嬌，穆佳琦，柴浩然，成姍育，尹仁福

(吉林大學 動物醫學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062)

蜱蟲是專性吸血的體外寄生蟲，是僅次于蚊子的第二大媒介，可傳播細菌、病毒和原生動物等，對公共衛生和畜牧業發展造成嚴重危害。新興細菌感染性疾病中的很大一部分是由蜱蟲等人畜共患病媒介傳播的。這些疾病中最突出的是萊姆病、埃里希體病和巴爾通體病[1]。

伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi, B.g)是引起萊姆病的病原體。萊姆病(Lyme disease,LD)是一種機體多系統多器官炎癥性反應的人獸共患病[2]，現已廣泛分布于歐洲、亞洲，是美國最常見的蜱蟲傳播疾病，具有分布廣、傳播快、致殘率高的特點[3]。1986年在黑龍江省林海縣首次分離到伯氏疏螺旋體，證明了我國存在伯氏疏螺旋體。目前已證實我國30多個省(自治區、直轄市)存在伯氏疏螺旋體感染，20個省、市、自治區存在自然疫源地[4]。

無形體科埃里希氏體屬的成員在人類和動物中引發埃里希氏體病[5]。埃里希氏體是一種專性的胞內寄生菌，除野生動物宿主外，家畜、伴侶動物和人類也均為其易感宿主[6]。自1935年在阿爾及利亞發現第1株埃里希氏體后[7]各地不斷出現埃里希氏體病例，目前已有研究人員在我國犬、鼠、羊、蜱及人體內檢測到埃里希氏體核酸及抗體[8]，顯示我國可能存在該病的自然疫源地。

隨著經濟水平的提高，人與自然接觸逐漸增多，以蜱蟲為媒介的傳染病如萊姆病和埃里希氏體病的診斷與防控已引起人們的關注。目前主要通過將血細胞進行吉姆薩染色，鏡下觀察是否存在桑葚體來確診埃里希氏體病，而萊姆病的診斷雖有現行有效的國家標準，但其推薦的病原分離及血清學檢測操作難度大，周期長，對操作人員要求較高，且目前缺少同時診斷這兩種疾病的方法及標準，而聚合酶鏈式反應(PCR)由于特異性好，操作簡單成為一種廣泛應用的實驗室檢測方法[9]。因此建立一種同時診斷萊姆病及埃里希體病的分子生物學診斷方法成為亟待解決的問題，也可為國家標準的制定提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體伯氏疏螺旋體B31標準菌株、埃里希氏體、鉤端螺旋體、立克次體、大腸桿菌、綠膿桿菌基因組樣品由本實驗室保存；蜱蟲樣品于2018年采集自黑龍江省佳木斯市牛體表；pGEM?-T Easy 載體系統購自普洛麥格生物技術有限公司。

1.2 主要試劑Wizard?Genomic DNA Purification Kit購自普洛麥格生物技術有限公司；DH5α感受態細胞由本實驗室保存；凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自Axygen公司；PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix、2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye)、DL2000 DNA Marker等試劑購自北京全式金生物技術有限公司；其他試劑為國產或進口分析純。

1.3 引物合成擴增埃里希氏體groEL基因保守區域及伯氏疏螺旋體ospA基因全長，并選取上述基因保守序列設計熒光定量PCR引物，根據蜱細胞色素C氧化酶Ⅰ基因(cytochrome coxidase subunit Ⅰ,Cox Ⅰ)設計蜱種鑒定引物[10],詳見表1。引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 陽性標準質粒構建參照Wizard?Genomic DNA Purification Kit說明書提取純化伯氏疏螺旋體基因組，通過普通PCR方法擴增埃里希氏體基因組樣品中熱休克蛋白groEL保守區域(使用Ehr-groel-F和Ehr-groel-R引物，反應程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，53℃ 1 min，72℃ 1 min，40個循環;72℃ 10 min)及伯氏疏螺旋體表面A蛋白ospA全長(使用ospA F和ospA R引物，反應程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 90 s，30個循環；72℃ 10 min)。反應體系：上、下游引物各2 μL；2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye) 15 μL；ddH2O 7 μL；模板4 μL。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，凝膠回收，連接至pGEM?-T Easy載體并轉化到E.coliDH5α感受態細胞中，提取重組質粒，使用T載體通用M13引物通過PCR方法鑒定，將鑒定陽性質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。經序列比對后，將陽性質粒分別命名為pT-groEL及pT-ospA。

1.5 反應條件優化通過普通PCR方法優化退火溫度，依據引物Tm值±5℃范圍內每2℃設置1個溫度梯度，并用矩陣法優化引物濃度：0.2～1.0 μmol/L，每0.2 μmol/L設置1個梯度。

1.6 熒光定量PCR標準曲線建立測定陽性標準質粒pT-groEL及pT-ospA濃度，依據拷貝數計算公式，將標準質粒稀釋為1×1010拷貝/μL。用Nuclease-Free Water將陽性標準質粒10倍梯度稀釋為1×1010～1×101拷貝/μL。運用上述反應體系及條件，進行單引物單模板熒光定量PCR，每組重復3次，輸出標準曲線。

1.7 熔解曲線分析將通過最優反應條件擴增獲得熔解曲線雙峰的Tm值，與單引物單模板熒光定量特異性熔解曲線單峰相比較，驗證Tm值吻合程度。

1.8 特異性檢驗運用上述方法對鉤端螺旋體、立克次體、大腸桿菌、綠膿桿菌基因組進行檢測，評價其特異性。

1.9 重復性檢驗隨機選取3個等濃度的pT-groEL和pT-ospA標準質粒為模板，使用上述熒光定量PCR方法連續擴增3次，通過對Ct值、Tm值等數據進行分析，驗證方法的穩定性。

1.10 敏感性檢驗以梯度稀釋后的pT-groEL及pT-ospA標準質粒為模板，使用上述方法進行雙重熒光定量PCR擴增，利用熒光定量PCR儀不能檢出熒光信號時的稀釋濃度和Ct值，推算本方法所能檢出的敏感性下限。

1.11 臨床樣品檢測及符合度評價將采集自黑龍江省佳木斯市的蜱蟲樣品，依據形態學差異分類，70%酒精清洗3次，用研缽將液氮冷凍后的蜱蟲組織磨碎，參照Wizard?Genomic DNA Purification Kit說明書對蜱蟲樣品全基因組DNA進行提取和純化。使用蜱種鑒定引物Cox Ⅰ擴增(反應程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 40 s，35個循環；72℃ 10 min，反應體系同1.4)后經瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，經Blast比對后，確定蜱蟲種類。使用本研究建立的方法對可能攜帶埃里希氏體和伯氏疏螺旋體的蜱基因組樣品進行檢測。

將上述基因組DNA作為模板運用埃里希氏體dsb基因[11]及伯氏疏螺旋體的5S～23S間隔序列[12]引物通過普通PCR方法進行驗證，經瓊脂糖凝膠電泳后測序，測序結果用Blast比對。

2 結果

2.1 陽性標準質粒構建成功構建陽性標準質粒pT-groEL及pT-ospA，通過目的基因特異性擴增及載體通用引物鑒定與預期大小一致(圖1)，且測序結果正確。

M.DL2000 DNA Marker；1.特異性引物擴增；2.M13通用引物擴增

2.2 反應條件優化依據反應條件優化結果，確定雙重PCR反應的最優反應程序：94℃ 30 s，94℃ 5 s，50℃ 15 s，72℃ 45 s，40個循環；最佳反應體系:PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix 10 μL，Nuclease free Water 4.5 μL，上、下游引物分別為groEL 0.75 μmol/L，ospA 1 μmol/L，2種陽性標準質粒各1 μL。以DEPC水為模板設置陰性對照。

2.3 標準曲線建立每個稀釋梯度的重復樣品Ct值相同，隨著標準品稀釋程度的增加，Ct值逐漸增大。并根據標準質粒濃度與Ct值建立相關性，分別建立標準曲線的相關系數(R2)，具有較好的線性相關性，其中埃里希氏體標準曲線：y=-3.108 5x+37.99，R2=0.983 3(圖2)，伯氏疏螺旋體標準曲線：y=-3.114 2x+35.367，R2=0.993 1(圖3)。通過對拷貝數x與Ct值之間的線性關系進行推算，可對檢測樣品進行定量。

1～10.標準質粒濃度為1×1010～1×101拷貝/μL；11.陰性對照

2.4 熔解曲線分析本研究所建立的方法在1條平滑的熔解曲線上產生了2個特異性的峰值，分別對應埃里希氏體和伯氏疏螺旋體的Tm值，與單引物熒光定量產生的熔解曲線Tm值相吻合(圖4)。結果判斷：實時熒光定量PCR反應結束后，觀察熔解曲線峰值(Tm值)分析試驗結果：若檢測樣品出現陽性擴增信號且在Tm=(78.12±0.40)℃出現單一的特異性峰判為埃里希氏體陽性；若檢測樣品出現陽性擴增信號且在Tm=(80.2±0.14)℃出現單一的特異性峰判為伯氏疏螺旋體陽性；若Tm=(76.61±0.34)℃和Tm=(80.2±0.14)℃均出現峰值，表明埃里希氏體和伯氏疏螺旋體混合感染。

2.5 特異性檢驗運用本研究所建立雙重熒光定量PCR方法對埃里希氏、伯氏疏螺旋體、鉤端螺旋體、立克次體、大腸桿菌、綠膿桿菌基因組進行檢測，僅試驗組埃里希氏體及伯氏疏螺旋體出現特異性擴增，其他組均無交叉反應(圖5)。

1～10.標準質粒濃度為1×1010～1×101拷貝/μL；11.陰性對照

1.埃里希氏體單引物擴增；2.伯氏疏螺旋體單引物擴增；3.雙重熒光定量PCR擴增；4.陰性對照

圖5 埃里希氏體和伯氏疏螺旋體雙重熒光定量PCR特異性檢驗

2.6 重復性檢驗本研究所建立的方法輸出熔解曲線重合度較高，對應Tm值較為穩定，標準差均小于0.1，變異系數(CV)均小于0.1%(表2)；說明本方法擴增重復性好，有良好的穩定性。

表2 雙重熒光定量PCR的不同濃度重復性分析

2.7 敏感性檢驗用本研究建立的埃里希氏體和伯氏疏螺旋體雙重熒光定量PCR檢測方法對梯度倍比稀釋的標準質粒進行檢測，得出該方法對埃里希氏體及伯氏疏螺旋體的檢測下限均為1×101拷貝/μL(圖6) 。

1～10.標準質粒濃度為1×1010～1×101拷貝/μL；11.陰性對照

2.8 臨床樣品檢測及符合度評價經形態學分類及PCR鑒定(圖7)，瓊脂糖凝膠電泳顯示目的片段與預期大小一致，獲得序列經比對確定蜱蟲種類均為全溝硬蜱。分別使用普通PCR和雙重熒光定量PCR檢測方法，對25份全溝硬蜱基因組DNA樣品進行檢測(圖8，9)，檢測結果見表3，其中陽性樣品Ct值為11.08～20.49，本研究建立的方法中埃里希氏體檢出率為28%，伯氏疏螺旋體檢出率為60%，與普通PCR方法樣品檢出率高12%。

表3 臨床樣品檢測結果 份

3 討論

埃里希氏體病檢測的金標準間接免疫熒光(IFA)是最早用于埃里希氏體病檢測的實驗室診斷方法，但該病原培養周期長、需要特殊細胞系，培養難度高，且與該屬其他病原存在交叉反應，易出現假陽性結果，臨床上并不常用。萊姆病的臨床表現復雜多樣，傳統的實驗室檢測主要包括病原和血清學檢查。病原菌檢測由于病原體分離率低，生長緩慢，操作周期長，難以及時準確的診斷，血清學檢測抗體間可能出現交叉反應，具有一定的不準確性，并且無法判斷特異性抗體是持續出現還是反復出現[13]。

多重熒光PCR方法具有檢測效率高，即多重熒光PCR可以實現一管多檢，簡化操作流程，節省試劑成本和操作時間，尤其是在開展大量樣品檢測時，顯著地降低檢測成本和操作時間等優勢。本研究選用性價比較高的SYBR Green Ⅰ染料法熒光定量PCR，利用SYBR Green 染料的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量之間的線性關系，對PCR體系存在的雙鏈DNA數量進行監測并利用熔解曲線為鑒別診斷提供了理論和技術支撐[14]。熔解曲線是反映DNA的雙螺旋結構隨溫度升高產生降解程度的曲

A.蜱蟲樣品背側觀；B.蜱蟲樣品腹側觀；C.部分蜱蟲樣品CoxⅠ基因鑒定結果；M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2～5.部分蜱蟲樣品擴增結果

A.埃里希氏體陽性樣品dsb基因鑒定結果(M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2～6.埃里希氏體陽性樣品)；B.伯氏疏螺旋體5S～23S間隔序列鑒定結果(M.DL2000 DNA Marker；1～10.部分伯氏疏螺旋體陽性樣品；11.陰性對照)

圖9 部分陽性樣品雙重熒光定量PCR檢測結果

線，其總的DNA雙螺旋結構降解一半時的熔解溫度稱為Tm值，Tm值與基因序列中的G-C值相關，所以，當擴增產物由于G-C值的不同而出現相對應的不同Tm峰值時，可以通過這個特征峰將特異產物與其他產物區分開，達到鑒別診斷的目的。

伴侶groEL是一種熱激蛋白，輔助蛋白質的加工和裝配，具有重要的免疫原性，可刺激T細胞和B細胞并直接誘導細胞因子的分泌。胞內寄生菌可將groEL蛋白分泌到宿主細胞質中。埃里希氏體groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性，常用作分子流行病學調查及菌種鑒定的靶基因[15]。

萊姆疏螺旋體主要的外膜蛋白有6種，其中ospA(the outer surface protein A)存在于90%的伯氏疏螺旋體中，是最主要的外膜蛋白之一。研究表明，ospA對螺旋體在硬蜱中腸定居至關重要[16]，其編碼基因是分子生物學診斷的主要檢測靶基因，對多位點進行PCR診斷的同時也可對伯氏疏螺旋體進行分型[17]。

本研究成功建立同時診斷埃里希氏體病和萊姆病的雙重熒光定量PCR方法，該方法反應條件及程序同時適用于普通PCR擴增反應，為同時對埃里希氏體和伯氏疏螺旋體的分子流行病學調查和埃里希氏體病及萊姆病的防控提供技術支持，由于本研究選擇的基因在宿主蜱及患病動物體內均可表達，故本研究同時具有檢測患病動物血液是否含有菌株的潛力，有待后續研究的進一步探索。