冠突散囊菌對潰瘍性結腸炎模型小鼠的保護作用及機制

景 悅，路曉杰，曹永國，張乃生

(吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因不明的慢性腸道炎癥，在人類和動物中均存在一定的發病率[1]。UC表現為免疫異常，病程較長并伴發許多并發癥，具有一定的癌變率甚至可誘發死亡[2]。目前UC患者可通過藥物治療控制病情，包括氨基水楊酸、糖皮質激素和免疫抑制劑等。這些藥物雖可使病情得到緩解，但均會引起不同程度的副作用[3]。而且，有些患者無法獲得持久的緩解，必須通過手術切除大部分甚至全部結腸，但手術治療常會引起各種術后并發癥；因此，當務之急是尋找新的可用于UC防治的療法。

UC發病機制比較復雜，涉及遺傳易感性，腸道上皮屏障缺陷，免疫失調和環境因素等[4]。據報道，巨噬細胞反應失調與UC的發生和發展高度相關，過表達的促炎因子增加了UC的發病率[5]。核因-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)是調節炎癥的重要途徑，當IκB磷酸化時，下游的NF-κB信號通路可通過p65易位激活進入核內，從而改變相關炎癥基因的表達。越來越多的研究表明，NF-κB參與了UC的發病機制，并且有針對性地抑制NF-κB可以減輕UC的預后[6]。而且，抑制NF-κB途徑激活可降低促炎細胞因子水平[6]。因此，探索調節NF-κB的新治療策略可能對UC治療有廣闊的前景。此外，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號通路也是主要的炎癥途徑，在調節細胞因子的分泌中起關鍵作用[7]。 從ZHANG等[8]的研究可知，MAPK信號通路在葡萄糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導的UC小鼠中被顯著激活。另外，腸道屏障是保護腸道健康的重要防線。結腸中緊密連接(tight junction,TJ)蛋白的結構異常是引發UC患者腸屏障破壞的重要因素之一[9]。

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum,E.cristatum)是一種用于發酵茯磚茶的益生真菌，越來越多的研究表明，E.cristatum具備多種生物活性及藥理價值，例如提高機體免疫力、降血脂、抗炎、抗腫瘤、調節腸道菌群等作用[10]。然而，關于E.cristatum對UC的作用及其潛在機制尚無明確信息。本試驗采用DSS誘導的UC小鼠模型來探索E.cristatum對UC的治療作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DSS(MK 36 000～50 000 Da)購自MP Biomedicals公司；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，白介素-1β(IL-1β)和白介素10(IL-10)ELISA試劑盒購自Biolegend公司；IκB，p65，p38，p-IκB，p-p65，p-p38，β-actin等一抗購自Cell Signaling TE.cristatumhnology 公司；HRP標記的二抗山羊抗兔抗體和山羊抗小鼠抗體購自Immunoway公司；TJ蛋白occludin一抗購自北京博奧森生物技術有限公司；即用型免疫組化超敏UItraSensitiveTMS-P檢測試劑盒購自福建邁新生物技術公司。

1.2 制備E.cristatum挑取茯磚茶葉上黃色菌落置于生理鹽水中，75℃水浴5～10 min后，倍比稀釋，并在麥芽糖瓊脂培養基上涂開，于30℃恒溫條件培養3～5 d。挑取單菌落進行測序，經鑒定是E.cristatum后，-80℃保存備用。

1.3 實驗動物及分組將40只8周齡雄性C57BL/6J小鼠(遼寧長生生物技術有限公司，中國遼寧)隨機分為4組：對照(Control)組，Control/E.cristatum組、DSS 組，DSS/E.cristatum組(每籠5只小鼠，每組10只小鼠)。試驗開始前，小鼠于(24±1)℃適應新環境1周。試驗期間，Control組和Control/E.cristatum組小鼠每天自由飲水，DSS組和DSS/E.cristatum組小鼠每天飲用1.5% DSS，其中Control組和DSS組小鼠灌服無菌生理鹽水(每只小鼠0.2 mL/d)，Control/E.cristatum和DSS/E.cristatum組小鼠灌服E.cristatum(每只小鼠3×107孢子/d)，每天記錄體質量，并根據建立的評分系統評估疾病活動指數(DAI)，持續7 d。于試驗結束后，處死所有小鼠，并收集相關樣品用于后續分析。

1.4 組織病理學觀察收集的結腸組織用10%中性福爾馬林緩沖液固定，脫水，石蠟包埋，以 5 μm 的厚度切片后用蘇木精和曙紅(HE)進行染色，并在光學顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.5 炎性細胞因子測定將結腸組織在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(1∶9)中勻漿，并將混合物在4℃、12 000 r/min 離心15 min后，收集上清液并用于炎性細胞因子測定。按照ELISA試劑盒說明書方法測量TNF-α、IL-1β和IL-10的水平。

1.6 Western blot檢測按照試劑盒說明書方法提取結腸組織中的總蛋白。將蛋白質樣品在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠上分級分離，并轉移到PVDF膜上，用30% BSA封閉，加入適當的一抗4℃過夜。次日，將蛋白膜與適當的二抗孵育，最后使用顯影液進行顯影。

1.7 免疫組織化學檢測根據試劑盒說明書方法檢測occludin蛋白。將每個載玻片與一抗occludin(1∶500)在4℃孵育過夜，用PBS洗滌，然后與HRP標記的山羊抗兔抗體孵育。然后，將每個切片用新制備的二氨基聯苯胺染色，最后將玻片在蘇木精中復染，并在氨水中返藍后于顯微鏡下觀察圖像。

2 結果

2.1E.cristatum對DSS誘導小鼠結腸炎的緩解作用DAI評分是衡量UC嚴重程度的常用參數，是糞便黏稠和直腸出血的綜合評分。Control組小鼠的體質量和DAI評分始終無顯著性變化。與Control組小鼠相比，DSS組小鼠體質量明顯減輕，DAI評分顯著增加。但是，E.cristatum干預促使UC小鼠的上述指標發生了顯著改善(圖1A，B)。此外，與Control組相比，DSS組小鼠的結腸長度明顯縮短，而E.cristatum明顯改善了DSS造成的結腸縮短的情況(圖1C，D)。與此同時，Control/E.cristatum組小鼠的各項指標相對于Control組沒有明顯變化，說明該劑量的E.cristatum對正常小鼠無副作用。

A.體質量變化；B.DAI評分；C，D.結腸長度

2.2E.cristatum對DSS誘導小鼠結腸炎結腸組織的保護作用病理組織學結果表明，Control組小鼠的結腸組織結構較為完整，腸上皮細胞的形態清晰可見。而DSS可引起急性炎癥，其特征是杯狀細胞大面積丟失，隱窩消失，炎性細胞浸潤和上皮細胞破壞。與DSS組相比，DSS/E.cristatum組的黏膜損傷情況得到了緩解。這表明E.cristatum可以有效地改善UC小鼠的腸道病理組織學變化(圖2A)。

TJ蛋白occludin是維持上皮細胞完整性和通透性的必不可少的機械屏障，其表達程度與結腸組織的健康程度密切相關。免疫組織化學結果表明，DSS組小鼠的結腸組織中occludin表達明顯降低，而E.cristatum干預后可明顯改善UC小鼠腸屏障的完整性(圖2B)。

2.3E.cristatum對DSS誘導小鼠結腸炎炎性因子的調節作用為了探討E.cristatum對炎性細胞因子水平的影響，本試驗檢測了結腸組織中促炎細胞因子(TNF-α和IL-1β)和抗炎細胞因子(IL-10)的表達。結果表明，與對照組相比，DSS組小鼠的結腸組織中TNF-α和IL-1β水平顯著升高，而IL-10水平上顯著降低。E.cristatum干預后，UC小鼠的3種炎癥細胞因子的分泌水平均得到了顯著性改善(圖3A～C)。

A.組織病理學變化；B.腸屏障的完整性

*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001。下同

2.4E.cristatum對DSS誘導小鼠結腸炎炎癥通路的影響已有研究證實了NF-κB信號途徑和MAPK信號途徑與腸道內炎癥的發病機理密切相關[11-12]。磷酸化p65、IκB蛋白代表NF-κB信號途徑的激活狀態，磷酸化p38代表MAPK的激活狀態。結果顯示，與Control組小鼠相比，DSS組小鼠的結腸組織中磷酸化p65、IκB和p38的表達顯著上調，E.cristatum干預顯著抑制了UC小鼠結腸組織中磷酸化p65、Iκ-B和p38的水平(圖4)；表明E.cristatum可以通過抑制NF-κB和MAPK信號傳導的激活發揮抗炎作用。

圖4 Western blot檢測p65、p-p65、IκB、p-IκB、p38和p-p38的蛋白表達(A，C)及量化分析(B，D)

3 討論

UC是一種病因不明，對直腸和結腸有害的疾病。近年來，UC的發病率和患病率在全球范圍內逐年增加，但其病因和發病機制尚未完全闡明。AHMED等[13]研究認為UC主要與遺傳、感染、環境和免疫有關。UC的藥物治療主要基于氨基水楊酸、激素和免疫抑制劑，雖然可以控制UC癥狀，但肝毒性、激素抵抗性、副作用等問題難以解決。因此,更為合理及有效的替代治療法仍然有待發現。近年來，多種天然食物成分被發掘于治療UC。橙皮苷可通過降低結腸組織中的髓過氧化物酶(MPO)活性和丙二醛(MDA)含量來下調血清中IL-6的水平[14]。大蒜素能調節CD68、MPO、MDA和炎癥因子表達，從而改善DSS誘導的UC[15]。GAO等[16]發現綠原酸通過抑制MAPK / ERK / JNK信號通路在UC的治療中發揮作用。E.cristatum是存在于茯磚茶中的優勢真菌，對茯磚茶的顏色和風味起著重要作用，E.cristatum與金黃色葡萄球菌混合發酵的次級代謝產物對腫瘤細胞具有較強的細胞毒性[17]。KANG等[18]研究發現E.cristatum可通過調節腸道菌群改善肥胖。E.cristatum具有多種生物活性及藥用價值，但目前尚未有其改善UC的作用的報道；因此本試驗以DSS誘導的小鼠作為UC動物模型探究E.cristatum對UC的保護作用及相關機制。

DAI評分是評估UC嚴重程度的主要參數[19]。在DSS組小鼠中，DAI分數顯著增加，但是，E.cristatum明顯改善了DSS處理小鼠的DAI評分。此外，E.cristatum還改善了DSS引起的結腸縮短。本試驗從病理組織學分析發現，DSS處理可導致隱窩和杯狀細胞明顯丟失，但是，E.cristatum顯著改善了這些變化，表明E.cristatum對DSS誘導的UC具有保護作用。而且，Control/E.cristatum組的各項指標相對于Control組沒有明顯變化，表明在試驗劑量下，E.cristatum對機體沒有副作用。

研究表明，UC的發病機理與炎癥環境息息相關。UC患者的腸道上皮細胞會沉浸在慢性炎癥細胞因子環境中，同時會產生過量的促炎細胞因子[20]。在本試驗中，DSS可顯著升高結腸組織中TNF-α和IL-1β的水平，而E.cristatum干預后顯著下調了UC小鼠結腸組織中的這些促炎細胞因子。作為多效抗炎細胞因子，大多數造血細胞均可產生IL-10[21]。本試驗結果表明，E.cristatum干預可提高UC小鼠結腸中IL-10的水平。

UC是一種免疫相關疾病，NF-κB是調節固有免疫反應和炎癥的關鍵轉錄因子。激活的NF-κB通過參與調節結腸和直腸黏膜中免疫細胞的浸潤，達到抑制UC的作用。NF-κB的激活主要是通過其抑制劑IκB的磷酸化和解離來實現的，在DSS誘導的結腸炎模型中，IκB和p65的磷酸化水平明顯增加[22]。本試驗結果顯示，E.cristatum可以降低IκB和p65蛋白的磷酸化水平，從而抑制NF-κB的活性。MAPK是一種高度保守的絲氨酸蛋白酶，參與介導細胞分化、增殖、分裂和凋亡的過程，MAPK途徑與腸道損傷有關[23]。在MAPK中，p38被認為是主要激酶，可以被多種細胞因子、激素和蛋白質誘導[24]。近年來，人們越來越意識到MAPK/p38信號通路在UC的發病機制中的重要作用[25]。本試驗發現E.cristatum可以改善UC小鼠的MAPK 信號通路中p-p38蛋白的表達，結果表明，E.cristatum可通過抑制NF-κB和MAPK分子途徑的激活發揮出色的抗炎功能。

腸道上皮細胞的TJ是維持細胞完整性和通透性的必不可少的機械屏障。據報道，UC患者的TJ蛋白如occludin的表達量明顯降低[26]。因此，調節TJ蛋白對于治療UC至關重要。本試驗通過免疫組織化學分析了occludin的表達，結果表明，E.cristatum處理抑制了DSS誘導的occludin表達水平下降，表明E.cristatum可能在維持occludin表達中起著至關重要的作用，從而平衡了屏障的完整性并減輕了對結腸的損害。

綜上所述，E.cristatum可明顯地降低UC的嚴重程度，修復受損的結腸組織及腸道屏障，調節炎性因子，具有一定的抗炎效應，且這一效應很有可能是通過調控 NF-κB 信號通路和 MAPK 信號通路的激活來實現的。因此，E.cristatum可能是防治UC的一種新的天然產物，這對人類與動物的UC在臨床上的治療與推廣具有一定的指導意義。