禽源Klebsiella variicola引起宿主血流感染的SNP篩選分析

尹 磊，沈學懷，張丹俊，趙瑞宏，戴 銀，胡曉苗，周學利，潘孝成

(安徽省農業科學院 畜牧獸醫研究所 安徽省畜禽疫病研究中心 畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031)

Klebsiellavariicola是肺炎克雷伯菌復合體家族成員之一，作為一種新出現的人獸共患病原菌，它對宿主具有多種感染方式，其中最常見也是最嚴重的方式是血流感染(bloodstream infection，BSI)[1]。近年來，由Klebsiellavariicola引起的感染事件頻繁發生，不僅嚴重威脅著人類的健康，而且對畜牧業的發展造成了巨大的經濟損失[2]。Klebsiellavariicola的致病性主要依賴于自身攜帶的毒力因子，這與先前在肺炎克雷伯菌中描述的毒力因子是相對應的，主要有莢膜、脂多糖(LPS)、鐵載體和菌毛等[3]。

BSI是細菌等病原微生物侵入血液生長繁殖并產生大量毒素和代謝產物，它會導致高度活躍的炎癥免疫反應，隨后誘導過多的炎性細胞因子或趨化因子，進而引起的嚴重全身性感染綜合征，可導致感染性體克、急性呼吸窘迫綜合征、彌散性血管內凝血甚至多器官功能障礙綜合征等一系列并發癥，是感染性疾病最嚴重的表現形式之一[4]。為了引起BSI，病原微生物必須避開血流中的多種宿主防御機制，包括吞噬作用、血清補體和抗菌肽的殺菌作用。事實上，抗血清殺菌能力已被證明是病原微生物的一個重要毒力特征[5]。研究表明，Klebsiella的致病特性與其血清抗性密切相關，莢膜和LPS在細菌抵抗血清殺菌活性中發揮著重要作用，其主要機理可能是通過限制C3補體蛋白在細菌表面的沉積、阻斷膜攻擊復合物或其他一些尚不清楚的機制來促進Klebsiella的血清抵抗力，從而引起宿主的BSI[6]。此外，動物血清中的鐵被轉鐵蛋白等宿主化合物隔離，導致游離鐵的濃度極低[7]，由于鐵是一系列細菌功能所必需的，因此，Klebsiellavariicola是否通過調控自身新陳代謝，以適應血清中可獲得的營養物質，這一過程還有待研究探討。

轉錄組測序(RNA-sequencing，RNA-Seq)可以對基因轉錄產物進行分類分析，確定功能基因的轉錄結構,常用于新基因的挖掘、已有基因結構的優化、可變剪接事件的尋找以及RNA水平上的單核甘酸多態性(SNP)篩查等[8]，為進一步研究相關基因的功能提供參考。目前，關于Klebsiellavariicola在抵抗血清殺菌活性的研究國內外尚無報道，因此，本研究采用RNA-Seq技術比較了禽源Klebsiellavariicola在LB肉湯培養基和SPF雞血清中的轉錄組SNP，篩選出Klebsiellavariicola在宿主血清中生存和發展相關的SNP位點，為進一步研究禽源Klebsiellavariicola導致宿主BSI的相關基因提供參考，從而為Klebsiellavariicola致病機理的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株AHKv-S01分離自安徽某家禽養殖場，經全基因組測序鑒定為野生型致病性Klebsiellavariicola，由安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所保存，GenBank登錄號為CP047360。

1.2 細菌培養挑取AHKv-S01的單菌落接種于LB肉湯中，37℃、150 r/min振蕩過夜培養。次日，以1∶100比例分別接種于LB肉湯中和SPF雞血清，振蕩培養至菌液D600 nm值為0.4～0.6，4℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液，菌體沉淀用無菌PBS洗滌3次，收集菌體沉淀，-80℃保存備用。

1.3 RNA-Seq測序提取LB組和SPF雞血清組的總RNA，使用Illumina公司生產的Ribo-Zero Magnetic Kit(Bacteria,MRZB12424)消化核糖體RNA，加入打斷試劑將RNA打斷成短片段；以打斷后的RNA為模板，用6堿基隨機引物合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應體系合成二鏈cDNA。在cDNA二鏈合成時以dUTP代替dTTP，然后連接不同接頭，再利用UNG酶法將含有dUTP的1條鏈進行消化，只保留連接鏈不同接頭的cDNA一鏈；使用試劑盒純化cDNA一鏈；純化的cDNA一鏈再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增；構建好的RNA文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer質檢合格后，使用Illumina測序儀進行測序。

1.4 數據分析測序所得的數據稱為raw reads，隨后對raw reads進行質控(QC)，以確定測序數據是否適用于后續分析。質控合格后，將過濾之后的clean reads 比對到參考基因組上。通過統計比對率、reads在參考序列上的分布情況等，判斷比對結果是否通過第2次質控(QC of alignment)。若通過，基于樣本與參考基因組的比對結果，利用Samtools軟件進行染色體坐標排序、去重等處理，再用Samtools、Bedtools等軟件預測樣本中的SNP位點。為了降低SNP檢測的錯誤率，使用 QUAL(a quality score associated with the inference of the given allele) ≥20，且DP(combined depth across samples)≥4進行過濾結果。然后利用SnpEff等軟件進行功能注釋，對篩選出的SNP位點所對應的基因進行GO功能顯著性富集分析、pathway顯著性富集分析，篩選出與抗血清殺菌能力相關的基因。

1.5 qRT-PCR熒光定量驗證隨機選取7個SNP位點對應的基因，以GenBank公布的dnaE基因作為內參基因。用Primer(Version 5.0)軟件分析并設計特異性引物，引物序列見表1。采用SYBR GreenⅠ方法進行mRNA表達量分析，數據采用2-ΔΔCt法進行處理。

表1 引物信息

2 結果

2.1 SNP篩選與分析以QUAL≥20且DP≥4為標準篩選SNP位點。相較于LB組，血清組分別獲得210 434，195 472，150 845個SNP位點，通過韋恩圖取3組的交集，獲得143 682個SNP位點(圖1)，其中檢測到單個堿基的轉換(transition)有100 790個，顛換(transversion)42 890個，包括A-C(4 444個)，A-G(24 078個)，A-T(3 315個)，C-A(4 576個)，C-G(9 123個)，C-T(26 181個)，G-A(25 838個)，G-C(9 398個)，G-T(4 631個)，T-A(3 116個)，T-C(24 693個)，T-G(4 287個)。在所有檢出的SNP中，轉換類型總數(A-G，C-T，G-A和T-C)極顯著高于顛換類型總數(A-C，A-T，C-A，C-G，G-C，G-T，T-A和T-G)(P<0.01)；而轉換類型SNP中，A-G，C-T，G-A和T-C并不存在顯著性差異(P>0.05，圖2)。此外，對獲得的SNP位點所在區域進行統計發現SNP主要集中在外顯子區域(131 093個)，這些SNP相較于其他區域的SNP更容易引起基因的有效突變，從而導致基因功能及菌株性狀發生差異(圖3)。

每部分中的數字表示不同血清組的SNP的數量

圖2 SNP突變類型統計

圖3 SNP所在區域統計

2.2 SNP對應基因的GO富集分析通過對SNP位點所在基因進行GO富集分析，篩選3種分類(biological process、cellular component、molecular function)中對應差異基因數目大于2的GO條目，按照每個條目對應的-log10Pvalue由大到小排序的各10條,篩選前30條GO條目(圖4)。結果顯示，基因參與的生物過程主要富集在DNA脫烷基化與DNA修復、DNA去甲基化、γ-氨基丁酸分解代謝過程、鐵同化過程、蛋白水解過程等；細胞組分主要有細胞外膜的組成部分、硝酸還原酶復合物、核酸外切酶修復復合物、膜的組成部分、孔復合體等；分子功能主要有醇脫氫酶(NADP+)活性、甲基化DNA- [蛋白質]-半胱氨酸S-甲基轉移酶活性、組氨酸磷酸轉移激酶活性、鎳陽離子跨膜轉運蛋白活性、磷酸泛素結合等。

圖4 GO富集分析圖(Top 30)

2.3 SNP對應基因的KEGG富集分析將位于基因外顯子區域的SNP結合RNA-Seq測序數據，進一步富集獲得上述SNP位點所在的候選差異基因，在此基礎上結合KEGG注釋結果，利用KEGG數據庫對其所在基因進行信號通路分析，發現SNP位點對應的基因主要富集在8個與宿主抗血清殺菌能力相關的通路上，其中ABC轉運蛋白158個，鐵載體基團非核糖體肽的生物合成5個，細菌的趨化性4個，二元調控系統63個，群體感應35個，磷酸轉移酶系統25個，LPS生物合成7個，細菌分泌系統9個(圖5)。

圖5 KEGG通路富集

2.4 熒光定量PCR分析SNP對應基因的mRNA轉錄表達水平隨機選擇7個位于KEGG富集通路中的基因，通過熒光定量PCR比較LB組與SPF血清組各基因mRNA轉錄水平，結果表明(圖6)，相較于LB組，SPF血清組各基因mRNA轉錄水平顯著上調(P<0.01)。

圖6 qRT-PCR分析SNP對應基因mRNA轉錄表達水平

3 討論

Klebsiellavariicola是革蘭陰性機會性病原體，在人和動物感染中普遍存在，長期以來，Klebsiellavariicola和Klebsiellapneumoniae表現出相似的生化特征；因此，Klebsiellavariicola常被誤認為是肺炎克雷伯菌，隨著基因組測序技術和系統分型方法的發展，Klebsiellavariicola作為一種新的人獸共患病原菌被鑒定[9-10]。人感染Klebsiellapneumoniae的重要性已為所知，但對Klebsiellavariicola的相關知識還很匱乏。最新的研究表明，在成人患者中，由Klebsiellavariicola引起的BSI與30 d死亡率最高相關，而與Klebsiellapneumoniae感染相關的死亡率相比則較低，同時，在患有血流感染的宿主中，Klebsiellavariicola的臨床分離率更高。相關研究顯示，雖然Klebsiellavariicola的毒力不如典型的臨床Klebsiellapneumoniae分離株，但由Klebsiellavariicola引起的感染會造成更為嚴重的后果[11]。迄今為止，很少有研究報道農場動物中存在Klebsiellavariicola感染，對農場動物健康生產的潛在風險知之甚少。本研究從安徽省某養禽場分離到1株禽源Klebsiellavariicola，該菌能造成雛雞孵化率顯著降低，其感染方式是BSI，通過RNA-Seq分析該菌在雞血清中生存和生長的SNP位點來評判Klebsiellavariicola在發病機制中的重要作用，從而為防控Klebsiellavariicola提供新的策略。

在基因組水平上，由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態性即稱為SNP,SNP可進行復雜性狀的關聯分析，從而揭示相關性狀的機理[12]。本試驗利用血清這種生長條件來模擬Klebsiellavariicola在宿主感染期間遇到的條件，進而去洞察Klebsiellavariicola適應血清所需SNP位點對應的變化，從而為解析Klebsiellavariicola引起的BSI性狀的調控機理提供理論參考。一直以來，Klebsiellavariicola被認為是開放性的基因組，其原因在于它能通過適應不同的環境條件來整合毒力因子的變異程度，從來增強自身的致病性[13]。本試驗結果顯示，血清組SNP位點的變化對應的基因主要富集在鐵載體的生物合成，二元調控系統，群體感應系統，LPS的生物合成等，這與Klebsiellavariicola目前已鑒定出的毒力因子是相對應的，也提示了SNP位點的變化與Klebsiellavariicola對毒力基因的整合程度有一定的關聯性。

病原菌在宿主體內生存繁殖的過程中，會不可避免的感受特定刺激信號的調控，通過激活一系列與毒力相關的基因來作出應答反應，形成復雜的級聯式或特定的復合體式協同調控網絡，耐受或逃避宿主的防衛機制，最終引發宿主致病[14]。在本研究中，Klebsiellavariicola適應宿主血清環境的過程中，SNP位點的變化涉及到多種信號調控網絡的改變，包括二元調控系統、群體感應系統、細菌的化學趨化系統、磷酸轉移酶系統、ABC轉運蛋白、鐵載體的合成以及LPS的生物合成等。二元調控系統是病原菌對各種環境信號作出反應的一個重要機制，病原菌通過感應外界環境的變化而產生相應的信號，通過二元調控系統接收信號進而啟動一系列相關基因的轉錄、翻譯和表達，發揮相應的生物學功能[15]。二元調控系統的存在使得病原菌在入侵宿主體內的過程中大大地降低了被宿主免疫系統清除的可能性，這一過程包括病原菌在宿主的血清環境[16]。本試驗結果提示Klebsiellavariicola的二元調控系統在調控對宿主抗血清殺菌活性中發揮重要作用，但該信號的轉導與Klebsiellavariicola毒力調節之間的關系還有待進一步的探討。細菌的化學趨化性能確保其逃離不利的生存環境，從而增強生存上的競爭優勢[17]，這種競爭優勢可能是Klebsiellavariicola能夠在宿主血清環境中生存和發展的重要因素。群體感應系統是細菌群體對信號分子的協同應答，從而在多細胞水平上傳遞級聯信號的過程，最終使細菌利用群體的力量來應付宿主的免疫清除。群體感應系統可以調控病原菌的多種生理學功能，其中最主要的是調控生物被膜的形成[18]。我們推測生物被膜的形成使Klebsiellavariicola能夠形成協調的生存策略，從而適應宿主的血清環境并促進Klebsiellavariicola的存活，具體過程還有待后續進一步的驗證。當病原菌內化到宿主細胞時，它們需要適應可利用營養物質的新陳代謝，主要是宿主細胞中的碳源。例如碳水化合物磷酸轉移酶系統(PTS)主要是通過磷酸級聯反應將各種糖及其衍生物進行磷酸化然后運輸到胞內。其不僅參與碳、氮中心代謝，還調節鐵、鉀穩態，調控某些病原體的毒力，還能介導應激反應。在這些不同的調節過程中，信號由PTS組分的磷酸化狀態提供，而該磷酸化狀態根據PTS底物的可用性和細胞代謝狀態的變化而變化[19]。在本研究中，PTS可能通過干擾Klebsiellavariicola的整體代謝來影響其在血清中的存活。據報道，病原菌在抵抗宿主的血清殺菌能力的過程中，LPS通過介導補體蛋白形成連鎖反應在菌體表面聚集成復合物，從而保護細菌不被殺滅[20]，此外，鐵是細菌生長繁殖的關鍵分子，是許多細胞過程所必需的。然而，由于Fe3+在生理條件下的不溶性以及Fe2+和Fe3+對宿主的限制，導致血清中的游離鐵很少。為了促進病原菌在血清中的存活力，因此，入侵的細菌病原體編碼高親和力的鐵獲取系統來抵消宿主的營養免疫過程[21]。鐵載體是細菌內部合成的小分子，然后輸出。在細胞外，鐵載體以極高的親和力結合環境中的鐵，并被運回細胞內，為細菌提供生長所需的鐵，在這個過程中，ABC轉運蛋白系統發揮著重要的作用，致病菌分泌的鐵載體的高親和性鐵離子-復合物分子通過ABC轉運體的鐵離子通道來實現重新吸收[22]。此外，本試驗從上述SNP位點對應基因富集的信號通路中隨機選取的7個基因，經qRT-PCR檢測，發現在血清中Klebsiellavariicola基因的mRNA轉錄水平是顯著上調的，這除了與先前的研究結果相兼容以外，對一些新的基因或調控系統在Klebsiellavariicola抗血清殺菌能力的解釋中似乎也是合理的。

本研究利用RNA-Seq比較Klebsiellavariicola在LB肉湯培養基和SPF雞血清中的SNP，發現篩選出的SNP所在的基因主要富集在二元調控系統、群體感應系統、細菌的化學趨化系統、磷酸轉移酶系統、ABC轉運蛋白、鐵載體的合成以及LPS的生物合成等途徑。本研究對禽源Klebsiellavariicola在宿主血液環境中生存和發展的分子機制進行了初步分析和探索，為進一步研究Klebsiellavariicola的致病機制提供理論依據。