水貂細小病毒IgG抗體間接ELISA半定量檢測方法的初步建立

朱翔宇，蔡熙姮，魯榮光，卜 研，柏 玲，朱言柱，廉士珍，白 雪，閆喜軍，胡 博*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟動物疫病重點實驗室，吉林 長春 130112)

水貂細小病毒(mink enteritis virus，MEV)屬于細小病毒科(Parvoviridae)、細小病毒屬(Parvovirinae)，是引起水貂病毒性腸炎的病原。水貂病毒性腸炎是一種急性、高度接觸性，以劇烈腹瀉為主要特征的嚴重危害養(yǎng)貂業(yè)的重要傳染病之一[1-2]。1981年，姜延秀等[3]首次報道我國發(fā)現(xiàn)疑似水貂病毒性腸炎疫情，隨后該病在國內(nèi)各水貂養(yǎng)殖省份逐漸蔓延，給水貂養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[4]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，水貂病毒性腸炎的暴發(fā)呈季節(jié)性、地方性和周期性等特點，且MEV具有強大的抵抗力，可以在獸籠和土壤中存活1年，病毒傳播可通過直接接觸感染水貂或間接接觸污染飼養(yǎng)器具、工作人員和飼料等，另外還發(fā)現(xiàn)昆蟲、鼠類和鳥類也可作為機械傳播媒介進行傳播[5]。水貂病毒性腸炎是養(yǎng)貂業(yè)的重點防控傳染病之一，尚無特異性治療方法，定期進行免疫接種是降低發(fā)病率和死亡率的有效手段，但是仍有新的MEV變異株的發(fā)現(xiàn)和流行，水貂病毒性腸炎的防控依舊面臨嚴峻考驗[6-7]。

細小病毒為無囊膜單鏈負股DNA病毒，基因組全長約5 000 bp，病毒基因組包含2個主要的開放式閱讀框(ORF1和ORF2)，3′端的為ORF1，編碼DNA轉(zhuǎn)錄與復(fù)制所需的非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structure protein)NS1和NS2;另一個開放式閱讀框為ORF2位于5′端，編碼組成衣殼結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)蛋白(structure protein)VP1、VP2[8]。MEV在血清學(xué)上與同屬的犬細小病毒(canine parvovirus，CPV)和貓泛白細胞減少癥病毒(feline panleukopenia virus，F(xiàn)PV)存在交叉反應(yīng)[9]。細小病毒的中和抗原表位主要位于VP2上，VP2基因全長1 755 bp，編碼584個氨基酸，是組成病毒衣殼的主要成分，具有特殊的結(jié)構(gòu)和免疫活性基團，編碼細小病毒的主要抗原決定簇能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體，可有效保護易感動物免受細小病毒感染[10]。

目前，國內(nèi)還沒有國家批準和市售的MEV血清學(xué)檢測試劑盒。因此本研究通過引入伴侶蛋白重組載體與含His標簽的VP2重組蛋白載體在大腸桿菌中共表達，將表達獲得的可溶性目的蛋白作為包被抗原對水貂血清抗MEV抗體進行檢測，并制備了陽性參考品作為參考，初步建立了檢測水貂血清中特異性MEV IgG抗體水平的半定量間接ELISA方法，為研發(fā)相應(yīng)的血清學(xué)診斷試劑奠定了基礎(chǔ)，可應(yīng)用于MEV疫苗免疫后抗體水平的監(jiān)測和疫苗免疫效力的評價，對隱性感染或發(fā)病的動物進行早期、快速確診及MEV的防控具有重要臨床實踐意義。

1 材料與方法

1.1 病毒及血清MEV MEVB株(FJ592174，105.5TCID50/0.1 mL)、水貂源MEV陰性抗血清、水貂源MEV陽性抗血清、水貂源犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)陽性抗血清、水貂源阿留申病毒(Aleutian disease virus,ADV)陽性抗血清、小鼠源抗MEV腹水單抗、pET22b-VP2-Tf16重組表達質(zhì)粒，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟動物疫病重點實驗室制備并保存。

1.2 主要試劑BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司；His標簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)購自江蘇康為世紀生物科技有限公司；Ni-NTA His-Band Resin，0.22 μm濾器購自Millipore公司產(chǎn)品；BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自寶生物工程(大連)有限公司；IPTG購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；脫脂乳購自BD公司；酪蛋白，TMB顯色液購自Sigma公司；BSA，辣根過氧化酶(HRP)標記羊抗雪貂IgG(H+L)抗體購自KPL公司；氨芐青霉素、氯霉素、L-阿拉伯糖均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 VP2蛋白的制備將pET22b-VP2-Tf16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中，以含有氨芐青霉素和氯霉素抗性的平板挑選陽性克隆菌落接種于含氨芐青霉素、氯霉素和L-阿拉伯糖的LB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)。當(dāng)D600nm達到0.5～0.7時，加入IPTG到終濃度為0.2 mmol/L，25℃，160 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h，同時設(shè)pET-22b載體空白對照、未加入IPTG的對照及未加入L-阿拉伯糖的對照。4℃、8 000×g離心20 min收集菌體后用PBS重懸，于冰浴上超聲破碎菌體，4℃、12 000×g離心15 min，收集上清，經(jīng)0.22 μm濾器過濾后按照His標簽可溶性蛋白純化試劑盒說明書的步驟進行可溶性蛋白的純化。最后使用Elution buffer(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.9，500 mmol/L Imidazole)洗脫獲得可溶性蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度后-80℃保存。

1.4 MEV重組VP2蛋白間接ELISA檢測方法的建立

1.4.1最佳抗原濃度和最佳樣品稀釋度的確定 采用棋盤滴定法對最佳抗原濃度及待檢血清稀釋度進行篩選，以pH=9.6的碳酸鹽緩沖液作為包被液，稀釋抗原至不同質(zhì)量濃度(5.700,2.850,1.425,0.713,0.356,0.178 mg/L)，每孔加入100 μL不同質(zhì)量濃度的抗原包被酶標板，4℃條件下過夜包被。分別對MEV陽性血清、陰性血清進行梯度稀釋(1∶10,1∶20,1∶40,1∶80)，加樣體積為每孔100 μL，進行ELISA試驗以測定各孔D450 nm，設(shè)置復(fù)孔并以PBS為空白對照。通過計算相同稀釋度的陽性血清和陰性血清之間的D450 nm比值(P/N值)，選擇P/N值最大孔的稀釋倍數(shù)作為抗原和血清的最佳稀釋濃度。

1.4.2最佳酶標抗體稀釋度的確定 HRP Goat Anti-Ferret IgG(H+L)抗體分別以1∶500,1∶1 000,1∶2 000,1∶4 000,1∶8 000,1∶16 000進行稀釋，測定各孔D450 nm，通過計算P/N值，確定酶標抗體最佳稀釋度。

1.4.3最佳抗原包被條件的確定 將抗原分別于4℃ 12 h、37℃ 2 h條件下進行包被，每組設(shè)3個重復(fù)孔，測定各孔D450 nm，計算P/N值，以確定最佳包被條件。

1.4.4最佳封閉條件的確定 選取30 g/L BSA、1.5 g/L BSA、5 g/L脫脂乳，2.5 g/L脫脂乳、1 g/L酪蛋白和5 g/L羊血清作為封閉液，每孔加入300 μL，封閉時間分別設(shè)定為30,60,90,120 min，設(shè)置復(fù)孔，測定各孔D450 nm，通過計算P/N值，選擇封閉最佳條件。

1.4.5待檢血清和酶標抗體最佳孵育條件的確定 在室溫(約22℃)和37℃條件下分別對待檢血清進行孵育，設(shè)定時間為30,45,60，90 min，每組設(shè)2個重復(fù)孔，測定各孔D450 nm，計算P/N值，以確定待檢血清的最佳孵育條件；酶標抗體最佳孵育條件的篩選設(shè)置同上。

1.4.6TMB顯色反應(yīng)時間的確定 在室溫(約22℃)條件下設(shè)定不同顯色時間，分別為5,10,15，20 min，對陽性血清和陰性血清進行ELISA檢測，計算P/N值，以確定底物的最佳反應(yīng)時間。

1.4.7陽性參考品的制備及陰陽性臨界參考值的判定 將收集到的40份免疫后21 d的陽性血清(HI抗體效價為1∶128～1∶256，SN抗體效價為1∶512～1∶1 024)進行混合，采用飽和硫酸銨沉淀法進行抗體純化[11]。制備陽性參考品，使用BCA試劑盒測得抗體最終濃度。將純化后的抗體作為ELISA方法的陽性參考品，將其設(shè)定為100酶聯(lián)免疫單位(EIU)。EIU的計算公式[12]如下：

1.4.8特異性試驗 利用建立的間接ELISA方法分別對MEV陰陽性抗血清樣品、水貂ADV陽性抗血清樣品、水貂CDV陽性抗血清樣品進行檢測，以評估該方法的特異性。

1.4.9敏感性試驗 通過檢測連續(xù)稀釋的MEV陽性參考品(約為100 EIU)和陽性血清(SN抗體效價為1∶1 024)，將檢測結(jié)果與陰陽性臨界值進行對比，評估該方法的敏感性。連續(xù)稀釋度分別為1∶40,1∶80,1∶160,1∶320,1∶640,1∶1 280,1∶2 560,1∶5 120，每個稀釋倍數(shù)設(shè)置3個重復(fù)，測定各孔D450 nm，計算平均值和各個稀釋度的濃度值。

1.4.10重復(fù)性試驗 使用同一批次純化的VP2蛋白包被的酶標板，隨機選擇5份水貂血清樣品，重復(fù)測定3次，評價該方法的板內(nèi)重復(fù)性；使用3個批次純化的VP2蛋白包被的酶標板，隨機選擇5份水貂血清樣品進行檢測，重復(fù)測定3次，評價該方法的板間重復(fù)性。變異系數(shù)(CV)計算公式如下：

1.5 特異性IgG抗體水平與血清對MEV中和活性的比較參照文獻[13]所述方法，應(yīng)用微量中和試驗(固定病毒-稀釋血清法)檢測免疫后不同時間采集的水貂血清對MEV的中和活性，利用Reed-Muench方法計算抗體中和效價，同時用建立的ELISA方法檢測血清特異性IgG水平。x軸為血清中和抗體效價的對數(shù)(log2)，y軸為ELISA方法檢測結(jié)果計算所得的EIU水平，使用IBM SPSS Statistics 19.0軟件通過回歸分析法分析ELISA-IgG抗體水平與中和抗體水平之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 MEV抗體間接ELISA檢測方法的優(yōu)化

2.1.1抗原最佳包被質(zhì)量濃度與血清最佳稀釋倍數(shù) 如表1所示，隨著抗原包被質(zhì)量濃度的降低以及血清稀釋倍數(shù)的增大，陽性血清的D450 nm不斷降低，當(dāng)抗原包被質(zhì)量濃度為0.713,1.425 mg/L，血清稀釋倍數(shù)為1∶80時，P/N值均處于峰值，考慮到包被蛋白在保存過程中可能會降解的問題，因此選擇1.425 mg/L 作為抗原最佳包被質(zhì)量濃度，血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶80。

表1 最適包被質(zhì)量濃度與血清稀釋倍數(shù)的確定

2.1.2最佳酶標抗體稀釋度的確定 選擇不同質(zhì)量濃度的包被抗原和不同稀釋度的酶標抗體分別對陽性和陰性血清進行檢測，結(jié)果如表2所示，在不同抗原包被質(zhì)量濃度的條件下，酶標抗體稀釋度為1∶2 000 時，P/N值均為峰值，因此酶標抗體最佳稀釋度為1∶2 000。

表2 最佳酶標抗體稀釋度的確定

2.1.3最佳抗原包被條件的確定 選擇不同的包被條件對抗原進行包被，檢測陽性和陰性血清D450 nm，計算P/N值。結(jié)果如表3所示，包被條件為4℃ 12 h時，P/N值最大，因此選擇4℃ 12 h作為最佳包被條件。

表3 最佳抗原包被條件的確定

2.1.4最佳封閉條件的確定 選擇不同的封閉液和封閉時間對包被的ELISA板進行封閉，并對陽性和陰性血清進行檢測，結(jié)果如表4，當(dāng)封閉液為50 g/L 脫脂奶粉，封閉90 min時P/N值最大，因此確定該ELISA檢測方法中最佳封閉條件為50 g/L脫脂奶粉封閉90 min。

表4 最適封閉條件的確定

2.1.5待檢血清和酶標抗體最佳孵育條件 在室溫(約22℃)和37℃條件下分別對待檢血清進行孵育，設(shè)定時間為30,45,60，90 min，對陽性血清和陰性血清進行ELISA檢測。結(jié)果如表5所示，當(dāng)待檢血清于37℃孵育45 min時，P/N值最高，因此確定待檢血清最佳孵育條件為37℃孵育45 min。

表5 待檢血清最佳孵育條件的確定

在室溫(約22℃)和37℃條件下分別對酶標抗體進行孵育，設(shè)定時間為30,45,60，90 min，對陽性血清和陰性血清進行ELISA檢測。結(jié)果如表6所示，當(dāng)酶標抗體于37℃條件下孵育45 min時，P/N值最高，因此確定酶標抗體最佳孵育條件為37℃孵育45 min。

表6 酶標抗體最佳孵育條件的確定

2.1.6TMB顯色時間的確定 在室溫(約22℃)條件下設(shè)定不同顯色時間，分別為5,10,15，20 min，對陽性血清和陰性血清進行ELISA檢測。結(jié)果如表7所示，當(dāng)?shù)孜镉谑覝貤l件下反應(yīng)10 min時，P/N值最高，因此確定底物的最佳反應(yīng)時間為10 min。

表7 TMB顯色時間的確定

2.1.7優(yōu)化后的間接ELISA操作步驟 MEV VP2蛋白抗原包被質(zhì)量濃度為1.425 mg/L，包被條件為4℃ 12 h，包被液為0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)；洗板液為含1 mL/L吐溫20的TBS緩沖液，洗板程序為350 μL/孔，靜置1 min，洗板3次；封閉液為50 g/L的脫脂乳，300 μL/孔；封閉條件為37℃封閉1.5 h，洗板；待檢血清樣品1∶80稀釋，100 μL/孔，37℃孵育45 min，洗板；酶標抗體1∶2 000 稀釋，100 μL/孔，37℃孵育45 min，洗板；加入100 μL/孔TMB顯色液，室溫避光作用10 min；終止液為1 mol/L H2SO4100 μL/孔終止反應(yīng)，在15 min內(nèi)用酶標儀測定D450nm值。

表8 陰性血清檢測結(jié)果

2.3 間接ELISA的特異性試驗利用建立的間接ELISA方法對水貂源CDV、ADV、MEV陽性抗血清及MEV陰性抗血清進行檢測，結(jié)果顯示，D450 nm值均低于14 EIU，說明該間接ELISA方法具有良好的特異性，與其他幾種病毒陽性抗血清之間未產(chǎn)生交叉反應(yīng)(圖1)。

圖1 間接ELISA的特異性試驗

2.4 間接ELISA的敏感性試驗利用建立的間接ELISA方法對連續(xù)稀釋的陽性參考品和陽性血清進行檢測，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)陽性參考品和陽性血清經(jīng)2 560倍稀釋后D450 nm值大于14 EIU，判定為陽性，說明該間接ELISA方法具有良好的敏感性。

圖2 間接ELISA的敏感性試驗

2.5 間接ELISA的重復(fù)性試驗利用建立的間接ELISA方法，隨機選取5份水貂血清分別進行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗，對結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)CV均小于5%(表9)，表明該間接ELISA方法具有良好的重復(fù)性。

表9 間接ELISA重復(fù)性試驗(n=5)

2.6 MEV特異性IgG抗體水平與血清HI效價的相關(guān)性使用IBM SPSS Statistics 19.0軟件通過回歸分析法分析ELISA-IgG抗體水平與中和抗體效價之間的相關(guān)性，可知ELISA-IgG抗體檢測結(jié)果與中和抗體效價之間存在線性關(guān)系，呈顯著性正相關(guān)(r=0.946 1，P<0.001)(圖3)。

圖3 血清中和抗體水平與IgG抗體水平相關(guān)性分析

3 討論

用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可取自動物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用；重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒中表達的蛋白質(zhì)抗原；合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段[14]。目前已建立的病毒抗體ELISA檢測方法中，若以病毒作為包被抗原，需要大量細胞培養(yǎng)病毒并對病毒顆粒進行純化，存在著病毒純化操作復(fù)雜、制備成本較高、散毒風(fēng)險、產(chǎn)率低且批次間病毒含量不穩(wěn)定等問題。與細胞培養(yǎng)病毒和真核表達系統(tǒng)相比，原核表達系統(tǒng)在蛋白的融合表達中具有操作簡單、成本低廉、表達量高、純度高、純化方式簡易、可短時間大量制備且不易散毒等優(yōu)點。

近年來，已有報道通過不同表達系統(tǒng)成功對MEV VP2蛋白進行表達[15-21]。有研究發(fā)現(xiàn)，在適宜的條件下，大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得的VP2蛋白能夠通過自組裝形成直徑、結(jié)構(gòu)與天然病毒粒子相似的VLPs，因此大腸桿菌表達系統(tǒng)表達的VP2蛋白具有廣泛的應(yīng)用價值[22]，但完整的VP2基因難以在大腸桿菌表達系統(tǒng)中獲得可溶性表達，目的蛋白多以包涵體形式存在[20,23]。分子伴侶可以通過抑制新生肽鏈不恰當(dāng)?shù)木奂ＷC蛋白質(zhì)形成正確構(gòu)象，從而減少包涵體的形成[24]。分子伴侶蛋白可防止蛋白質(zhì)在密集細胞環(huán)境中發(fā)生錯誤折疊和聚集，在健康和應(yīng)激細胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合從而使其穩(wěn)定折疊，并在發(fā)揮作用后自行離開目的蛋白[23]，這些因素促使其成為了增加原核表達蛋白可溶性的重要手段。

分子伴侶質(zhì)粒pTf16顯著促進MEV VP2蛋白的可溶性表達[25]，但是通過分子伴侶pTf16與目的蛋白共表達得到的可溶性蛋白量仍低于酵母表達系統(tǒng)的表達量[26-27]。因此，本研究選取分子伴侶pTf16與表達VP2基因的大腸桿菌載體融合共表達獲得的可溶性重組VP2蛋白作為包被抗原，并成功建立了檢測MEV IgG抗體的間接ELISA方法，與2009年陳濤等[15]建立的以截短VP2基因片段原核表達的包涵體蛋白為抗原的ELISA方法相比較，抗原的免疫原性更好，制備抗原的成本更低、方式更便捷，所建立的檢測方法敏感性更高，更加適合成果轉(zhuǎn)化。

本研究對建立的間接ELISA檢測方法通過EIU的計算對樣品中MEV ELISA-IgG抗體水平進行評估，并確定陰性和陽性臨界參考值為14 EIU，當(dāng)檢測結(jié)果<14 EIU為抗體陰性，檢測結(jié)果≥14 EIU為抗體陽性；若以MEV中和抗體為1∶32為保護臨界值，當(dāng)檢測結(jié)果≥27.52 EIU時，免疫合格；當(dāng)檢測結(jié)果≥14 EIU且<27.52 EIU時，抗體沒有達到免疫保護標準；特異性試驗顯示該間接ELISA方法對CDV、ADV陽性抗血清沒有交叉反應(yīng)，以重組VP2蛋白為診斷抗原具有良好的特異性；對標準品血清倍比稀釋后進行檢測，結(jié)果表明，陽性參考品經(jīng)2 560倍稀釋后仍為陽性，說明建立的間接ELISA方法敏感性良好；在批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗中，CV均低于5%，說明該方法重復(fù)性良好。ELISA-IgG抗體檢測結(jié)果與血清中MEV的中和抗體效價之間存在線性關(guān)系，呈顯著性正相關(guān)(r=0.946 1，P<0.001)，為ELISA方法替代HI試驗和SN試驗提供了數(shù)據(jù)支持，為養(yǎng)殖場動物群體的抗體長期監(jiān)測工作及疫苗效價的評估等研究提供重要的技術(shù)方法。

近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)開始在定量免疫分析技術(shù)領(lǐng)域嶄露頭角，是一種結(jié)合經(jīng)典免疫學(xué)與高科技電化學(xué)的第3代免疫分析技術(shù)，具有更廣泛的研究和應(yīng)用用途。Meso Scale Discovery公司研發(fā)的基于微孔板的ECL技術(shù)已經(jīng)逐漸被應(yīng)用于多價疫苗效價評估、中和抗體測定和免疫原性評估等方向[28-32]。

綜上所述，本研究正確表達了具有生物學(xué)活性的可溶性MEV VP2蛋白，并成功建立了基于MEV VP2蛋白為檢測抗原的間接ELISA檢測方法，建立的MEV抗體ELISA方法可對疫苗免疫后的抗體水平進行半定量，可替代SN抗體水平評價疫苗的免疫效果。下一步可進行試劑盒組裝和評價，應(yīng)用于MEV免疫效果監(jiān)測及MEV抗體的流行病學(xué)調(diào)查。