雞毒支原體TM-1蛋白嵌合新城疫病毒樣顆粒的構建及鑒定

辛 梅，張 頔，李金斗，丁佳欣，于喜冰，徐小洪，丁 偉，邵亞男，單春輝，丁 壯

(吉林大學 動物醫學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春130062)

雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)屬支原體科、支原體屬，是介于細菌和病毒之間的一種病原體[1]。據流行病學調查顯示，我國養殖場內雞群的MG感染非常普遍[2-4]，MG感染后主要引起禽類的慢性呼吸道病(chronic respiratory disease，CRD)，呈慢性經過，造成產蛋率下降，飼料利用率降低，死亡率不高，但常與其他病原體如大腸桿菌、傳染性支氣管炎病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)等混合感染，導致病情變得復雜、癥狀加重、死亡率升高。臨床上雛雞感染MG后，在接種新城疫(Newcastle disease，ND)弱毒活疫苗時，也會導致發病，造成ND抗體顯著下降[5]。TM-1蛋白是由MG的VlhA5.02基因編碼的一種保護性蛋白，具有高度的保守性[6]，對于MG感染后的黏附過程十分重要。SAITO等[7]證明TM-1免疫雞群后，免疫保護率可達到80%，能夠有效抵御MG感染，可以作為開發新型重組疫苗的候選抗原。

ND是由副黏病毒科、禽腮腺炎病毒屬的NDV引起的急性、烈性、高度接觸性的傳染病[8]，具有高發病率和死亡率，是《國家中長期動物疫病防治規劃(2012-2020年)》指出的優先防治的動物疫病之一[9]。目前，隨著綜合防控措施的不斷加強，對于ND的防控取得了一定效果，ND流行得到了基本控制，但出現了新的流行病學特點即地方性、非典型性、免疫帶毒以及免疫失敗時有發生等[10]。

目前，養殖場雞群MG感染普遍，與NDV混合感染后會導致雞群癥狀加重，病情復雜，死亡率上升。而現存的針對MG的疫苗不能與ND疫苗同時使用，需要間隔一段時間，存在免疫窗口期，增加了雞群患病的風險。因此研制安全有效、免疫程序簡便的新型疫苗尤為重要。

病毒樣顆粒(virus-like particles，VLPs)是由病毒蛋白組成的納米級生物結構[11]。自1979年首次報道構建成功以來，各種病毒的VLPs不斷被成功研制，VLPs已成為新型疫苗研發的有利平臺。VLPs主要有以下幾個優點：不含病毒核酸，無法感染與自我復制，具有良好的生物安全性；具有與病毒相似的結構與空間形態，可有效激發體液免疫、細胞免疫以及黏膜免疫；VLPs允許外源基因的插入，能夠作為多功能的納米載體將外源蛋白高效展示于表面，構成嵌合VLPs，為制備多價或多聯疫苗提供可能。鑒于VLPs具有以上優點，本研究基于昆蟲桿狀病毒表達系統構建新型的MG TM-1蛋白嵌合NDV樣顆粒，來補充現有疫苗的缺陷，以期為ND與MG感染的防控提供新方法。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒及載體Sf9昆蟲細胞，E.coliDH10Bac感受態細胞，rBv-M、rBv-HN、rBv-F以及pFastBac1空載體均為本實驗室保存；E.coliDH5ɑ感受態細胞，pEASY-T Simple購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 主要試劑M5HiPer Taq HiFi PCR mix購自北京聚合美生物技術有限公司；昆蟲培養基Sf-900TMⅢ SFM (1X)購自Gibco公司；胎牛血清購自BI公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自Axygen公司；兔抗MG TM-1、兔抗NDV M、兔抗NDV F、兔抗NDV HN高免血清均由本室制備并保存；X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent購自ROCHE公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 引物設計根據GenBank NDV HN(DQ659677.1)的胞外域序列、MG TM-1(NO-004829.2)的核酸序列，分別設計上、下游rHN-TM-1-F、rHN-TM-1-R鑒定引物以及M13、pFastBac1通用引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 相關引物信息

1.4 目的基因的合成根據GenBank MG TM-1(NO-004829.2)的ORF序列，依次添加柔性肽序列(G4S)與GenBank NDV HN(DQ659677.1)的胞外域序列連接，并在上游添加SalⅠ酶切位點，下游添加KpnⅠ酶切位點，送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，命名為pUC-rHN TM-1。

1.5 表達rHN TM-1基因的重組穿梭質粒的構建及鑒定將pFastBac1空載體以及公司合成的pUC-rHN TM-1分別用SalⅠ、KpnⅠ進行雙酶切，經過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確后，膠回收其產物，連接、轉化至E.coliDH5ɑ感受態細胞。次日，挑取單菌落進行PCR鑒定，取鑒定正確的菌株接種至LB液體培養基，過夜培養，提取質粒。利用特異性引物以及pFastBac1通用引物鑒定正確后，送至測序，將鑒定正確的重組穿梭質粒命名為pFastBac1-rHN TM-1。

1.6 表達rHN TM-1基因的重組桿粒的構建及鑒定將pFastBac1-rHN TM-1轉化至E.coliDH10Bac感受態細胞，并進行3次藍白斑篩選、PCR鑒定，獲得陽性菌株。提取桿粒，將鑒定正確桿粒命名為rBacmid-rHN TM-1。

1.7 表達rHN TM-1基因的重組桿狀病毒的拯救與鑒定當6孔板內Sf9細胞密度為70%～80%時將rBacmid-rHN TM-1與轉染試劑按照1∶2的比例混合均勻，27℃培養96 h，收集上清，為P1代。將200 μL的P1代滴加入6孔板內細胞密度為70%～80%的Sf9細胞內，27℃培養96 h，收集上清為P2代，依次傳至P4代。收集P4代桿狀病毒，提取其基因組，分別用特異性引物及通用引物進行PCR鑒定，將結果正確的樣品命名為rBv-rHN TM-1。

1.8 表達rHN TM-1基因的重組桿狀病毒滴度的測定使用桿狀病毒滴度快速測定試劑盒測定病毒滴度，具體操作見說明書。

1.9 IFA檢測將rBv-M、rBv-HN、rBv-F、rBv-rHN TM-1以MOI=5共感染Sf9細胞，并分別設置未感染組作為對照，培養48 h后，用多聚甲醛溶液固定10 min，Triton通透10 min，分別以NDV M、NDV HN、NDV F、MG TM-1的多克隆抗體為一抗，FITC標記的豬抗兔IgG抗體為二抗，Hoechst染核處理，制備細胞爬片，然后利用激光共聚焦顯微鏡觀察各組分蛋白表達情況。

1.10 MG-ND cVLPs的產生與鑒定

1.10.1MG-ND cVLPs的產生 Sf9細胞懸浮培養至密度為2×106，將構建成功的P4代rBv-rHN TM-1與實驗室保存的rBv-M、rBv-HN、rBv-F以MOI=5共感染Sf9細胞，27℃、200 r/min培養96 h,收集細胞上清,分別經20%,30%,60%蔗糖密度梯度超速離心純化獲得cVLPs。

1.10.2MG-ND cVLPs的鑒定 將純化后的cVLPs進行Western blot鑒定并利用透射電鏡觀察其形態特征。

2 結果

2.1 重組穿梭質粒pFastBac1-rHN TM-1的鑒定利用特異性引物以及pFastBac1通用引物對pFastBac1-rHN TM-1進行PCR鑒定，將產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,結果可見大小為987，1 112 bp的2條條帶，與預期大小相符，送至測序結果無突變(圖1)。

M.DL5000 DNA Marker；1.特異性引物PCR擴增rHN TM-1基因產物;2.通用引物PCR擴增rHN TM-1產物

2.2 重組桿粒rBacmid-HN-TM-1的鑒定經藍白斑篩選3次后，三抗(Kan+Tet+GM)板所生長菌落均為白色，隨機挑取白色菌落，接至液體三抗LB，過夜培養后提取桿粒，分別用特異性引物以及M13通用引物進行PCR擴增并將產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結果顯示，特異性引物PCR產物大小為987 bp，通用引物PCR產物大小約為3 187 bp(圖2)。

2.3 重組桿狀病毒rBV-rHN TM-1的鑒定

2.3.1Sf9細胞病變觀察 將桿粒rBacmid-rHN TM-1轉染至Sf9細胞，用光學顯微鏡觀察發現，與正常Sf9細胞比較可見細胞生長緩慢，產生變大變圓、呈顆粒變性甚至脫落、破碎等典型病變(圖3)。

M.DL5000 DNA Marker；1～4.特異性引物PCR擴增rBacmid-rHN TM-1產物；5～8.通用引物PCR擴增rBacmid-rHN TM-1產物

2.3.2重組桿狀病毒rBv-rHN TM-1的鑒定 將桿粒rBacmid-rHN TM-1轉染至Sf9細胞，依次傳代，收集產生的桿狀病毒，提取P4代桿狀病毒的基因組，用特異性引物以及通用引物進行PCR鑒定，結果顯示，條帶大小與預期相符(圖4)。

2.3.3IFA檢測 利用激光共聚焦顯微鏡觀察cVLPs的各組分蛋白表達情況，可見各試驗組與對應未感染組相比均出現綠色熒光信號，表明各組分蛋白均正確表達(圖5)。

A.正常Sf9細胞；B.rBv-rHN TM-1感染后細胞

M.DL5000 DNA Marker；1.特異性引物PCR擴增rBv-rHN TM-1產物；2.通用引物PCR rBv-rHN TM-1產物

圖5 IFA檢測蛋白表達

2.4 MG-ND cVLPs的鑒定

2.4.1MG-ND cVLPs的透射電鏡觀察 透射電鏡觀察純化后的cVLPs形態，粒子呈球形，大小約為100 nm，表面存在纖突結構，與野生型NDV粒子相似(圖6)。

2.4.2MG-ND cVLPs的Western blot分析 將經過純化的MG-ND cVLPs進行Western blot 鑒定，結果顯示可與NDV M、NDV HN、NDV F、MG TM-1的多克隆抗體結合且條帶與預期的大小相符，其中NDV M因存在糖基化修飾，實際蛋白略大于40 kDa，NDV HN、NDV F 、rHN TM-1蛋白大小分別為70，55，35 kDa(圖7)。

3 討論

據流行病學調查顯示，我國養殖場內雞群MG的平均感染率高，致死率低[2-4]。雛雞感染后抵抗力降低，常與呼吸道有關疾病并發，如ND、傳染性支氣管炎等，混合感染后會導致死亡率上升。ND是由NDV引起的烈性傳染病，具有高發病率和死亡率。對于這兩種疾病的最有效防控措施為疫苗接種，然而，廣泛使用的傳統MG和NDV疫苗均為弱毒疫苗，均存在明顯不足。首先，NDV的弱毒苗主要為基因Ⅱ型的La Sota株，與我國目前流行的基因Ⅶ型NDV同源性僅為82%左右[12]，存在基因型不匹配的問題；第二，目前使用的MG活疫苗F36株，在免疫過程中必須與ND La Sota弱毒苗間隔使用，存在免疫窗口期，增加了雞群患病的風險；第三，活病毒疫苗可能造成輕微的呼吸道或消化道癥狀[13]；第四，作為活疫苗，本身具有基因突變以及與流行的野生毒株發生基因重組的問題[14]，存在散毒和毒力返強的風險；第五，目前使用的活病毒疫苗以及滅活病毒疫苗，難以區分野毒感染與疫苗株感染，而野毒抗體與疫苗抗體的區別對于疫病防控的監測十分重要。因此，制備一種安全有效、免疫程序簡便的ND-CRD疫苗刻不容緩。VLPs疫苗可以克服目前ND與MG疫苗使用的大部分問題。與活疫苗相比，VLPs不含病毒核酸，不能感染與自我復制，且排除了與野毒株重組的可能性，具有良好的生物安全性；與滅活疫苗相比，避免滅活疫苗滅活不徹底導致禽類個體發病的風險；與其他亞單位疫苗相比，VLPs作為外源性抗原可被抗原提呈細胞(APC)，特別是樹突狀細胞(DC)有效地攝取，然后由MHC Ⅱ類分子進行抗原處理和提呈，從而刺激CD4+T輔助細胞[15]。VLPs與天然病毒類似，也作為內源性抗原潛伏在DC細胞的胞漿中，并由MHC Ⅰ類分子呈現給細胞毒性CD8+T細胞(CTLs)[16]，這種交叉呈現機制確保了機體能夠產生全面且有效的免疫反應；此外，VLPs平臺也是適合應用于多種、多型的高突變RNA病毒[17-18]。NDV作為高突變率的RNA病毒，多種ND VLPs已被成功研制。在國內，錢晶等[19]證明了ND VLPs 可以有效誘導DC細胞的成熟。丁佳欣等[20]成功構建不同基因型的ND VLPs并證明了其具有良好的免疫原性以及免疫效果。此外，由于ND VLPs能夠高密度展示表面蛋白以及釋放率高等原因，在作為遞送外源抗原的載體方面也顯示出了巨大優勢。在不影響自身合成的情況下，可以通過GPI錨定或胞外域替換等方式將外源蛋白如布魯菌的BCSP31蛋白[21]，伯氏疏螺旋體的OspA、OspC蛋白[22]等展示于VLPs表面，經證明可以發揮較好的免疫原性以及有效抵御病原菌的攻擊。

A.野生NDV NA-1株;B.MG-ND cVLPs

M.蛋白Marker；A.MG-ND cVLPs M蛋白；B.MG-ND cVLPs HN蛋白；C.MG-ND cVLPs F蛋白；D.MG-ND cVLPs rHN TM-1蛋白

本研究基于昆蟲桿狀病毒表達系統，以NDV基質蛋白為骨架，利用胞外域替換的方式，將NDV的HN蛋白胞外域替換為MG的TM-1蛋白，從而將TM-1蛋白嵌合至 ND VLPs表面，經激光共聚焦顯微鏡觀察顆粒各組分蛋白均表達成功，蔗糖密度梯度離心純化后，透射電鏡觀察可見大小約100 nm 的粒子，表面呈纖突結構，與野生型NDV大小一致；Western blot鑒定表達了NDV M、F、HN以及MG TM-1蛋白。因此，本研究成功構建了MG-ND cVLPs。雖然該cVLPs已成功制備，但其免疫原性以及免疫效果仍待進一步研究。綜上所述，MG-ND cVLPs的構建為防控ND與MG提供了新的解決方案，可達到簡化免疫流程、一針二防的目的，同時也為MG與其他病毒或細菌的混合感染提供了防控新思路。