豬血凝性腦脊髓炎病毒核衣殼蛋白可抑制Ⅰ型干擾素產生

楊雅雯，李 姿，張 競，王改麗，蘭云剛，李 芳，賀文琦，高 豐，宋德光*

(1.吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062；2.吉林省畜牧獸醫科學研究院，吉林 長春 130062；3.青島易邦生物工程有限公司 動物基因工程疫苗國家重點實驗室，山東 青島 266144)

豬血凝性腦脊髓炎是由豬血凝性腦脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV)引起的一種豬的傳染病，根據臨床癥狀可分為嘔吐型、脊髓炎型和流感型。仔豬為PHEV易感群體，死亡率較高，該病在全世界多個國家均有發生和流行，給養豬業造成嚴重的經濟損失，目前尚無特效的治療藥物和疫苗[1-2]。

天然免疫是機體抵抗病毒侵略的第一道防線，干擾素(IFN)是參與天然免疫應答的主要細胞因子，且β-干擾素(IFN-β)在抗病毒免疫中扮演著重要角色。病毒在感染復制過程中產生一種特殊的保守結構，稱為病原相關分子模式(PAMPs)，其被模式識別受體(PRRs)識別，經過一系列級聯信號分子的激活，最終誘導IFN-β的產生，并被IFN受體識別，發揮其抗病毒的免疫作用[3-5]。

已有研究表明，PHEV感染細胞早期能夠抑制樹突狀細胞分泌IFN-β[6]，而病毒蛋白在此過程中的作用及機制尚不清楚。故本研究利用多個病毒蛋白重組載體進行篩選，證明PHEV核衣殼(N)蛋白能夠抑制IFN-β表達，并且N蛋白對IFN-β的拮抗作用是通過與宿主細胞MAVS互作實現的。

1 材料與方法

1.1 細胞、毒株和質粒小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)、人腎上皮細胞(HEK-293T)、重組質粒(pcDNA3.1(-)-MAVS、eGFP-IRF3、myc-IRF3、IFN-β-luc、IRF3-luc、NF-κB-luc)以及PHEV-67N毒株(登錄號：AY078417)，均由吉林大學分子病理解剖實驗室保存。

1.2 主要試劑LipofectamineTM3000轉染試劑購自Invitrogen公司；放線菌酮、多聚次黃嘌呤-胞嘧啶核苷酸(Poly(I∶C))購自InvivoGen公司；MDA5、MAVS、IRF3、e-GFP、myc、flag等單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司；TRIzol reagent、SYBR Green Ⅰ購自Rocha公司；Mouse Interferon Beta ELISA Kit購自PBL公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司。

1.3 真核表達載體的構建參照GenBank中PHEV(登錄號：AY078417)編碼的M、N、E、nsp8、nsp9、nsp10、ns2、ns4.9以及ns12.7蛋白基因序列，利用Primer Premier 5.0進行特異性引物設計(表1)。PCR擴增上述基因，克隆至真核表達載體pEGFP-N1或pCMV-N-flag。

表1 PCR引物序列

1.4 細胞培養與轉染將RAW264.7或HEK-293T細胞接種于6孔細胞培養板中，于37℃、5% CO2條件下培養，待細胞生長密度為60%時，根據LipofectamineTM3000說明書進行轉染操作。其中，Poly(I∶C)轉染劑量為4 μg/孔，各種質粒轉染劑量為2～4 μg/孔。

1.5 熒光定量PCR檢測PHEV及IFN-β mRNA表達將生長狀態良好、生長密度為70%的RAW264.7細胞，接種PHEV(MOI=2或10)，16 h后，進行放線菌酮(100 mg/L)處理；藥物作用8 h后，TRIzol法提取總RNA，反轉錄形成cDNA。利用特異性引物檢測PHEV以及IFN-β mRNA表達水平。熒光定量PCR反應條件：95℃ 3 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環；70℃ 10 min。以次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)為內參計算相對表達量，引物序列見表2。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.6 Western blot檢測收集預處理的RAW264.7或HEK-293T細胞，加入RAPI裂解液(含1% PMSF)于冰上裂解。加入SDS緩沖液進行SDS-PAGE電泳，并濕轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉37℃封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜；PBST洗滌3次，羊抗兔或羊抗鼠二抗于37℃孵育1 h，PBST洗滌后，進行顯影。

1.7 雙熒光素酶報告基因系統檢測將HEK-293T細胞接種至12孔板，待細胞密度達到60%時，分別將PHEV主要病毒蛋白重組質粒(eGFP-N、flag-M、flag-nsp8、flag-nsp10、flag-ns4.9、flag-E、flag-nsp9、flag-ns2、flag-ns12.7)與螢火蟲熒光素酶報告基因質粒(IFN-β-luc、IRF3-luc、NF-κB-luc)以及海腎熒光素酶報告基因質粒(pRL-TK)進行共轉染，同時設置空載對照組。于轉染后16 h，進行Poly(I∶C)刺激處理，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書檢測目標基因的熒光信號強度。

1.8 免疫共沉淀試驗將生長狀態良好的HEK-293T細胞鋪至6孔細胞培養板，待細胞密度為70%～80%時，進行轉染試驗。轉染24 h后收集細胞并進行裂解，裂解產物分為兩部分：一部分作為input對照；另一部分加入相應抗體，與蛋白A/G瓊脂糖珠混合孵育(4℃過夜)，得到免疫共沉淀復合物，經裂解液洗滌后，進行Western blot檢測。

1.9 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)將PHEV N蛋白真核表達質粒(eGFP-N)轉染至RAW264.7細胞，16 h后再次轉染Poly(I∶C)，8 h后收集上清液，根據Mouse Interferon Beta ELISA kit說明書進行IFN-β表達量檢測。

1.10 統計學分析所有數據利用IBM SPSS Statistics 19進行t檢驗統計分析。P<0.05具有統計學意義。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

2 結果

2.1 PHEV病毒蛋白合成能夠抑制IFN-β表達RAW264.7細胞接種PHEV(MOI=2或10)后，進行放線菌酮處理以抑制病毒蛋白合成。熒光定量PCR及Western blot檢測發現，隨著病毒蛋白合成的減少(圖1A、B)，IFN-β生成量增加(圖1C)，表明PHEV編碼的病毒蛋白能夠拮抗IFN-β分泌。

A.放線菌酮處理感染病毒的細胞后PHEV mRNA檢測；B.放線菌酮處理感染病毒的細胞后PHEV N蛋白水平檢測；C.放線菌酮處理感染病毒的細胞后IFN-β mRNA檢測

2.2 PHEV N蛋白抑制Poly(I∶C)誘導的IFN-β表達為篩選能夠抑制IFN-β表達的病毒蛋白，本研究分別將PHEV主要病毒蛋白重組質粒與IFN-β-luc、pRL-TK共轉染至HEK-293T細胞。雙熒光素酶報告基因系統檢測表明，PHEV N蛋白能夠顯著抑制IFN-β表達，病毒其他結構蛋白(M和E)和非結構蛋白(ns2、ns4.9、ns12.7、nsp8、nsp9和nsp10)對IFN-β啟動子活性無顯著性影響(圖2A)。將PHEV N蛋白重組質粒(eGFP-N)轉染至RAW264.7細胞，ELISA檢測進一步證明，PHEV N蛋白高表達顯著抑制IFN-β分泌(圖2B)。

2.3 PHEV N蛋白抑制IRF3活性IFN-β的產生需要IRF3和轉錄因子κB(NF-κB)二者協同刺激作用[7]，為探究PHEV N蛋白對IRF3和NF-κB活性的影響，本研究將eGFP-N與螢火蟲熒光素酶報告基因質粒(IRF3-luc、NF-κB-luc)以及內參質粒pRL-TK共轉染至HEK-293T細胞。雙熒光素酶報告基因系統檢測發現，PHEV N蛋白可以抑制IRF3啟動子活性(圖3A)，但對NF-κB啟動子活性無顯著性影響(圖3B)，表明IRF3或IRF3上游信號分子為N蛋白調控IFN通路的作用靶標。

A.雙熒光素酶系統篩選抑制IFN-β表達的病毒蛋白；B.ELISA方法驗證N蛋白抑制IFN-β表達的作用

A.雙熒光素酶報告系統檢測N蛋白對IRF3啟動子活性的影響；B.雙熒光素酶報告系統檢測N蛋白對NF-κB啟動子活性的影響

2.4 PHEV N蛋白通過與MAVS信號分子互作抑制IFN-β產生為進一步確定PHEV N蛋白調控的IRF3上游信號分子靶標，本研究將RIG-I樣受體信號通路中IRF3的重要上游調控分子——線粒體抗病毒信號蛋白(pcDNA3.1(-)-MAVS)與eGFP-N、IFN-β-luc以及內參質粒pRL-TK共轉染至HEK-293T細胞。雙熒光素酶報告基因系統檢測表明，PHEV N蛋白能夠顯著降低MAVS誘導的IFN-β啟動子活性(圖4A)，提示MAVS是PHEV N蛋白拮抗IFN-β產生的潛在靶標。將eGFP-N和pcDNA3.1(-)-MAVS共轉染至HEK-293T細胞，免疫共沉淀試驗分析表明，PHEV N蛋白與MAVS信號分子存在相互作用(圖4B)，證明PHEV N蛋白通過MAVS信號分子抑制IFN-β產生。

A.雙熒光素酶系統篩選PHEV N蛋白的潛在作用靶點；B.免疫共沉淀驗證PHEV N蛋白與MAVS互作

3 討論

機體先天性免疫應答時產生的干擾素作為抵抗病毒作用的天然屏障具有重要意義，尤其在缺乏疫苗免疫的情況下至關重要。宿主細胞通過識別病原相關分子模式，進一步激活多級信號分子，最終誘導干擾素表達，從而發揮抗病毒作用。豬血凝性腦脊髓炎作為一種高度接觸性傳染病，具有較高的致死率，在世界范圍內廣泛傳播和流行，對養豬業構成嚴重威脅[8]。由于目前尚無有效的疫苗和藥物，早期的發現和防控成為預防該病的重點；因此，深入研究PHEV感染與宿主免疫應答的調控機制具有重要的科學意義。

在系統長期進化過程中，許多冠狀病毒(包括α、β、γ、δ屬)演化出拮抗宿主免疫系統的機制，且病毒蛋白是揭開病毒免疫逃避作用的重要突破口。PHEV與急性重癥呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、鼠肝炎病毒(MHV)等同屬于β冠狀病毒屬成員，且已被證明能夠抑制樹突狀細胞中IFN-β表達[6]，這一結果初步解釋了PHEV強致病性和高死亡率存在的可能原因——IFN-β不能在感染初期消滅病毒，病毒有足夠的時間復制增殖，從而發揮致病作用。

放線菌酮又名環乙酰亞胺，是由鏈霉菌產生的戊二酰亞胺類抗生素，具有廣譜、強抗病毒活性的特點，在體外抑制大多數真核生物蛋白的合成，被廣泛應用于體外真核細胞過程研究[9]。本試驗通過放線菌酮藥物處理感染病毒的細胞，明確PHEV病毒蛋白合成對IFN有拮抗作用，并以此為突破口展開研究。已有研究證明，牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)至少可編碼3個特定蛋白用于拮抗免疫應答反應[10]。丙型肝炎病毒(HCV)的ns2蛋白通過抑制TANK結合激酶1(TBK1)和IκBε激酶(IKKε)復合物拮抗宿主細胞的抗病毒應答[11]。中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV)M蛋白通過抑制IRF3磷酸化拮抗Ⅰ型IFN表達[12]。SARS-CoV中有11種病毒蛋白具有IFN拮抗作用，其中nsp1蛋白通過影響IRF3二聚化而抑制IFN-β表達，PLP蛋白通過阻斷STING-TRAF3-TBK1復合物形成實現免疫逃避[13-14]。本研究構建PHEV多種結構蛋白以及非結構蛋白真核表達質粒，通過篩選發現，N蛋白拮抗功能最為明顯。N蛋白是一類表達早、豐度高、功能保守且多樣的核衣殼蛋白。據報道，MHV、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)等冠狀病毒的N蛋白均能通過不同的分子機制拮抗IFN-β產生[15-18]，可見冠狀病毒調控抗病毒天然免疫的機制非常復雜。

為了進一步解析PHEV N蛋白拮抗IFN-β產生的機制，本研究通過將PHEV-N與IFN信號通路的信號分子互作，初步篩選出MAVS為潛在的互作靶標。據報道，PRRs識別PAMP后將信號通過MAVS傳遞給下游的TBK1-IKK-TRAF3復合體，從而激活IRF3和NF-κB等信號通路，以誘導Ⅰ型IFN表達，故MAVS是IFN信號通路的樞紐，具有銜接作用[3]。MAVS既可定位線粒體，也可定位于過氧化物酶體；因定位不同，發揮的抗病毒免疫機制不同，迄今已發現30多種分子可與MAVS相互作用[19]。多種病毒可編碼MAVS負調控分子，如HCV編碼的NS3/4A通過裂解MAVS，使其不再定位于線粒體而喪失激活下游信號分子的功能[20]；人類冠狀病毒NL6 PLP蛋白酶破壞MAVS-STING-TBK1/IKK復合體，阻斷MAVS功能的正常發揮，從而實現免疫負調控過程[21]。但PHEV感染過程中，MAVS定位的變化情況以及是否有其他信號分子參與N蛋白與MAVS的互作過程，仍需進一步深入研究。

本研究從病毒蛋白角度，證實PHEV可通過其自身合成的N蛋白與宿主細胞MAVS相互作用，從而抑制IFN-β產生。該結果有利于對PHEV致病性及逃避宿主免疫應答的理解，同時也可為疫苗設計及藥物靶標篩選提供新的思路。