ENO1基因過表達對籽鵝卵泡顆粒細胞糖酵解、凋亡及細胞周期的影響

計 紅，邵子益，薛琳琳 ，詹雪龍，邵百卉，郭景茹，李士澤，楊煥民，甄 莉*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院， 黑龍江 大慶 163319，2.黑龍江職業(yè)學院，黑龍江 雙城 150111)

α-烯醇化酶(α-enolase，ENO1)是烯醇化酶的一種，同時也是一種糖酵解酶，廣泛存在于動物機體各個組織、器官之中。ENO1是一種多功能蛋白，除了參與糖酵解功能以外，還參與多種生物學過程。近年研究發(fā)現(xiàn)，ENO1與癌癥存在密不可分的關(guān)系。喬慧[1]發(fā)現(xiàn)ENO1在胃癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織，且通過敲低ENO1基因可以顯著抑制胃癌細胞的增殖和克隆形成能力，并誘導胃癌細胞發(fā)生凋亡。資料顯示，ENO1也參與機體的免疫調(diào)節(jié)。孫溶勵[2]研究發(fā)現(xiàn)，針對ENO1介導的自身免疫反應(yīng)可引起小鼠流產(chǎn)增加。SAXENA等[3]研究發(fā)現(xiàn)了HIV-1通過Nef介導的ENO1調(diào)節(jié)的CAWLEAQ基序侵入宿主的可能機制，并確定其可為HIV-1進入黏膜屏障的潛在治療靶點。除此之外，ENO1與多種疾病的發(fā)病機制有著密不可分的關(guān)系，如BERRY等[4]研究發(fā)其為致糖尿病胰島特異性CD4+T細胞的候選基因，并提示其可能在Ⅰ型糖尿病發(fā)病機制中存在作用。

籽鵝是東北地區(qū)常見的產(chǎn)蛋家禽，具有較高的產(chǎn)蛋能力。卵泡生長發(fā)育是家禽產(chǎn)蛋涉及的最主要過程之一，通過調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育提高籽鵝產(chǎn)蛋率對畜牧生產(chǎn)意義重大。計紅等[5]對籽鵝產(chǎn)蛋期前后卵巢差異表達基因進行研究時發(fā)現(xiàn)，ENO1在產(chǎn)蛋期和非產(chǎn)蛋期表達量差異顯著。本實驗室近期的研究結(jié)果也顯示，ENO1可能對禽類卵泡顆粒細胞的增殖和凋亡具有重要影響，因此，本試驗應(yīng)用ENO1基因過表達載體轉(zhuǎn)染入原代培養(yǎng)的籽鵝卵泡顆粒細胞進行過表達，探索ENO1過表達對籽鵝卵泡顆粒細胞糖酵解、增殖、凋亡和細胞周期的影響，為后續(xù)禽類生殖生理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8月齡產(chǎn)蛋期健康雌性東北籽鵝6只，均購自大慶市北方種鵝場。

1.2 顆粒細胞的原代培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染取籽鵝6只，處死后分別取F1級卵泡，進行卵泡顆粒細胞分離，并將分離出的細胞進行復合培養(yǎng)[6]。本試驗分為3組：對照組、空載體組和ENO1過表達組。每組設(shè)置3個重復。細胞培養(yǎng)96 h時，將實驗室前期構(gòu)建好的ENO1基因過表達載體感染復數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)= 350轉(zhuǎn)染[7]。

1.3 ENO1基因過表達效果驗證轉(zhuǎn)染試驗完成后，Trizol(美國Invitrogen公司)法提取總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物)合成cDNA，并設(shè)計合成(上海生工)引物序列。ENO1 mRNA引物序列為：F：5′-GGTGCGGGGTGTTCAGATGTC-3′；R：5′-TCCACCAGCAGCCATCAA-3′。內(nèi)參(β-actin)：F：5′-CTGTCAAGGCTGAGAATG-3′ R：5′-CAAGAGGCATTGCTGACA-3′。腺病毒轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集培養(yǎng)液組、空載體組和ENO1過表達組的顆粒細胞，通過熒光定量PCR(試劑購自大連寶生物)檢測ENO1 mRNA的表達情況，擴增條件：94℃預變性10 s，94℃ 5 s，56℃ 30 s，72℃ 20 s，45個循環(huán)。

1.4 ENO1基因過表達對顆粒細胞糖酵解的影響分別收集各組顆粒細胞和培養(yǎng)液，采用葡萄糖測試盒(上海榮盛生物藥業(yè)有限公司)按說明書要求檢測細胞培養(yǎng)液葡萄糖濃度；采用丙酮酸測試盒、乳酸測試盒和ATP含量測試盒(南京建成生物工程研究所)說明書檢測培養(yǎng)液丙酮酸、乳酸含量及細胞ATP含量；采用實時熒光定量PCR(試劑購自大連寶生物)對丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)mRNA表達量進行檢測。PK基因引物序列：F：5′-GAACTGCGATGAGAATGTGC-3′；R：5′-ACCAGCAAGGAAATGAGACC-3′，引物由上海生工合成；條件同ENO1 mRNA定量。

1.5 細胞增殖、凋亡及細胞周期檢測方法本試驗采用WST-1(水溶性四唑鹽試劑)法(碧云天生物技術(shù)研究所)測定細胞生長曲線；AnnexinV-PE細胞凋亡檢測試劑盒(Elabscience)(碧云天生物技術(shù)研究所)檢測細胞凋亡率；PI單染法(美國BD Biosciences公司)檢測細胞周期。

1.6 統(tǒng)計學分析本試驗采用Graphpad 7.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，用ANOVA進行單因素方差分析顯著性，P<0.05為差異顯著；P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 ENO1 mRNA表達量檢測ENO1過表達組基因表達量極顯著高于空載體組和對照組(P<0.01)，空載體組與對照組表達量無顯著差異(P>0.05)，結(jié)果見圖1。

*P<0.05；**P<0.01。下同

2.2 顆粒細胞生長曲線細胞培養(yǎng)96 h前各組細胞數(shù)量無顯著性差異。從120 h開始，各組細胞均呈對數(shù)生長，但過表達組細胞數(shù)量明顯高于空載體組與對照組(P<0.05)，具有更快的生長速度，結(jié)果見圖2。

圖2 各組細胞生長曲線

2.3 顆粒細胞糖酵解相關(guān)指標檢測ENO1過表達組細胞培養(yǎng)液葡萄糖(glucose)含量顯著低于其他2組(P<0.05)，丙酮酸(pyruvic acid)(P<0.05)和乳酸(lactic acid)(P<0.05)含量顯著高于其他2組；細胞ATP含量極顯著高于空載體組(P<0.05)；PK mRNA ( PKM ) 表達量極顯著高于其他2組(P<0.01)，結(jié)果見圖3。

Glucose、 Lactic acid濃度單位：mmol/L；Pyruvic acid、ATP濃度單位：μmol/L；PKM為丙酮酸激酶mRNA相對表達量

2.4 顆粒細胞凋亡檢測結(jié)果流式細胞檢測結(jié)果顯示，ENO1過表達組G-mean值低于空載體組(P<0.01)，但高于對照組(P<0.05)，結(jié)果見圖4，5。

圖4 各組顆粒細胞凋亡檢測

圖5 各組顆粒細胞凋亡分析

2.5 顆粒細胞細胞周期檢測結(jié)果細胞周期分析結(jié)果顯示，ENO1過表達組G0/G1時期細胞百分比極顯著低于其他2組(P<0.01)，但S期、G2/M期細胞百分比顯著高于其他2組(P<0.05)，結(jié)果見圖6。

圖6 各組顆粒細胞周期結(jié)果分析

3 討論

ENO1是糖類代謝中的關(guān)鍵酶之一，在細胞新陳代謝中具有重要作用。多個研究發(fā)現(xiàn)，ENO1的表達與癌癥有著密切關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)ENO1在胃癌干細胞中高表達，提示其在調(diào)控胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力中發(fā)揮重要作用[7]。王磊等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ENO1在胰腺導管腺癌的表達顯著增高，提示其在胰腺上皮的癌變過程中可能發(fā)揮重要作用。而通過蛋白質(zhì)組學確定的8種肺癌生物標志物候選物中，ENO1在癌癥患者中的表達水平高于無癌癥個體[9]，這也進一步證實了ENO1的表達與癌癥發(fā)生息息相關(guān)。腫瘤細胞最主要的特征之一是細胞增殖迅速，凋亡率極低，這與禽類卵泡的生長速度相近。作為生長最快的正常組織，卵泡發(fā)育需要消耗大量的能量和反應(yīng)底物。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，禽類產(chǎn)蛋期卵泡ENO1基因表達量明顯升高[10]，提示ENO1可能在禽類卵泡生長過程中發(fā)揮重要作用。

本試驗顯示，ENO1基因的過表達使細胞培養(yǎng)液中葡萄糖濃度降低，丙酮酸、乳酸含量升高(P<0.05)；細胞ATP含量和PK mRNA表達量顯著升高(P<0.05)，細胞增殖速度加快，凋亡率降低，提示ENO1基因過表達可能通過增強對顆粒細胞糖酵解能力調(diào)控其生長發(fā)育與凋亡。陳曉亮[11]研究表明，ENO1基因過表達可以促進腫瘤細胞的遷移與侵襲，并能拮抗人顆粒體蛋白A對腫瘤細胞凋亡、遷移與侵襲及葡萄糖攝取功能的影響。SUN等[12]發(fā)現(xiàn)ENO1的敲減減弱了胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而ENO1過表達則相反，且ENO1通過AKT信號通路增強胃癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移。也有研究表明，ENO1的過表達使Hela細胞免受Mycoepoxydiene誘導的生長抑制[13]。羅起勝等[14]發(fā)現(xiàn)，ENO1在膠質(zhì)瘤中通過正向調(diào)控糖代謝相關(guān)基因因HK2和LDHA表達，從而促進了膠質(zhì)瘤細胞的生長。上述結(jié)果與本試驗結(jié)果一致，提示ENO1通過控制糖酵解來調(diào)控細胞凋亡，使細胞凋亡率顯著降低。但KANG等[15]研究顯示，ENO1可能在卵泡發(fā)育介導細胞凋亡，其研究結(jié)果與本試驗有所不同，其具體機制仍有待研究。

本試驗發(fā)現(xiàn)，ENO1過表達可使G0/G1期顆粒細胞比例下降，提示其可通過作用于細胞的DNA合成來調(diào)控細胞的增殖和凋亡。有研究證實ENO1表達上調(diào)可顯著抑制腫瘤細胞的體外侵襲和黏附能力，其抑制作用可能與調(diào)節(jié)細胞周期和侵襲相關(guān)基因表達有關(guān)[15]。資料顯示，穩(wěn)定上調(diào)的ENO1激活了FAK/ PI3K/ AKT及其下游信號，以調(diào)節(jié)糖酵解，細胞周期和EMT相關(guān)基因表達，顯著提高體外非小細胞肺癌細胞糖酵解、增殖、克隆形成、遷移和侵襲、以及體內(nèi)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移[16]。這與本試驗結(jié)果也一致，提示ENO1對顆粒細胞周期進程的穩(wěn)定具有重要作用，但其具體調(diào)節(jié)機制還有待進一步研究。

綜上所述，ENO1基因過表達可能通過提高卵泡顆粒細胞糖酵解水平促進細胞增殖，抑制凋亡，改變細胞周期時相性。