黑枸杞花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)的Raw264.7細(xì)胞炎癥的影響

薛才華，武 強(qiáng)，王夢(mèng)杰，劉嘉華，張龍飛，張家瑋，拉忠花，吳 華*，柴沙陀

(1.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué) 畜牧獸醫(yī)科學(xué)院， 青海 西寧 810000)

炎癥是指機(jī)體受到外界刺激后，通過(guò)利用系統(tǒng)本身的活體組織對(duì)外界致炎因子產(chǎn)生的一種防御作用。巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的重要組成成分，它參與機(jī)體的兩種免疫:特異性免疫與非特異性免疫，在炎癥反應(yīng)及疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1]。在體外試驗(yàn)中，常以脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞作為炎癥細(xì)胞模型。LPS是革蘭陰性菌外膜的主要成分[2]。常用其建立炎癥模型，它具有很強(qiáng)的致炎活性，當(dāng)LPS在機(jī)體內(nèi)進(jìn)行大量繁殖或正常死亡后會(huì)誘導(dǎo)多種炎性因子的分泌，引起機(jī)體炎癥，使機(jī)體在生理上表現(xiàn)出一系列臨床癥狀[3]。因此，LPS是細(xì)菌感染導(dǎo)致炎癥反應(yīng)過(guò)程中最主要的促炎因子[4]。花青素是植物界中分布最廣泛的天然色素家族 ，它是一種具有生物活性的化合物，存在于植物的葉、莖、花和果實(shí)中，具有多種藥理作用[5]。 研究發(fā)現(xiàn)，花青素具有抗氧化、抗炎、抑菌、抗衰老等作用[6-8]。但是黑枸杞花青素在小鼠Raw264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及其機(jī)制尚未明確。本研究以LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7作為體外炎癥細(xì)胞模型，觀察黑枸杞花青素對(duì)炎癥狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)炎癥因子含量及其mRNA水平的影響，并研究其對(duì)炎癥通路TLR4/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子mRNA水平的影響及其對(duì)TLR4、NF-κBp65蛋白的調(diào)控，來(lái)探討其對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥的保護(hù)作用，為黑枸杞花青素的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料細(xì)胞株：小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；黑枸杞花青素：購(gòu)自青海金麥杞生物科技有限公司(花青素61%，灰分0.6%，蛋白質(zhì)6%，糖1.32%，氨基酸3.56%)。

1.2 試驗(yàn)試劑LPS和胰蛋白酶購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基和雙抗購(gòu)自GIBCO公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自江蘇省海門(mén)碧云天生物技術(shù)研究所；ELISA試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；SYBR Green Ⅱ熒光定量PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司;抗體 TLR4和NF-κBp65購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；Ant-GAPDH購(gòu)自安諾倫生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)儀器超凈工作臺(tái)(江蘇通凈凈化設(shè)備有限公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(MU-5810E，美國(guó)NUAIRE公司);水平離心機(jī)(V18R,英國(guó)Dynamica公司)；酶標(biāo)儀(Power Wave XS2 Bio TeKR，Gene Company Ltd.USA)；電泳儀和熒光定量PCR儀(Bio-Rad 公司)；化學(xué)發(fā)光成像儀(北京賽智科技有限公司)。

1.4 試劑配制

1.4.1花青素溶液的配制 準(zhǔn)確稱取0.01 g花青素溶于10 mL DMEM培養(yǎng)基中，配成1 g/L的花青素母液，-20℃保存，使用前稀釋成相應(yīng)濃度。

1.4.2LPS溶液配制 將1 mg LPS粉末溶解于10 mL的PBS溶液中，配制成100 mg/L的LPS母液，分裝后保存于-80℃冰箱，使用前稀釋成相應(yīng)濃度。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)及分組小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7復(fù)蘇后，在37℃、5%CO2條件下，用含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)到80%左右，胰蛋白酶消化傳代，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于試驗(yàn)。細(xì)胞分為對(duì)照組、花青素組、LPS組、花青素+LPS組。其中花青素組和花青素+LPS組中花青素濃度使用課題組前期篩選出的25 mg/L，LPS組和花青素+LPS組LPS質(zhì)量濃度采用課題組前期篩選的1 mg/L。

1.6 ELISA法檢測(cè)小鼠Raw264.7細(xì)胞炎性相關(guān)因子的含量細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以每孔1×106個(gè)接種于96孔板中，按上述分組進(jìn)行試驗(yàn)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。收集各組細(xì)胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-6、IL-10、TNF-α和INF-γ的含量，將試劑盒提前20 min從冰箱內(nèi)取出，平衡至室溫。按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定相關(guān)因子吸光度值。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)小鼠Raw264.7細(xì)胞相關(guān)因子mRNA表達(dá)按上述分組進(jìn)行試驗(yàn)，使用TRNzol裂解液提取細(xì)胞的總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。如表1所示，使用上海生工設(shè)計(jì)合成的引物。

表1 引物序列

1.8 免疫印跡法檢測(cè)TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白表達(dá)按照上述分組進(jìn)行試驗(yàn)，處理完各組細(xì)胞后，棄去上清，收集各組細(xì)胞，加入適量的蛋白裂解液(含1%PMSF)，冰上反復(fù)吹打，4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，通過(guò) BCA 法進(jìn)行蛋白定量。制備8%分離膠，5%濃縮膠SDS-PAGE 電泳，上樣量為 2 g/L。半干轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5% BSA 室溫封閉1.5 h。TLR4，NF-κBp65一抗，4℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜3遍，二抗室溫孵育1.5 h，再次 TBST 洗膜3遍，ECL化學(xué)發(fā)光顯影拍照，凝膠成像儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 黑枸杞花青素對(duì)小鼠Raw264.7細(xì)胞炎性相關(guān)因子含量的影響ELISA法檢測(cè)黑枸杞花青素對(duì)LPS作用后小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ含量的變化。結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組相比，花青素處理組IL-6、IL-10的含量顯著升高(P<0.05)，TNF-α的含量升高，INF-γ的含量降低，差異均不顯著(P>0.05)，LPS處理組極顯著升高IL-6、TNF-α的含量(P<0.01)，IL-10和INF-γ的含量顯著升高(P<0.05)，花青素+LPS處理組TNF-α、INF-γ的含量升高但差異不顯著(P>0.05)，IL-10的含量極顯著提高(P<0.01)，IL-6的含量顯著提高(P<0.05)；與LPS處理組相比，花青素處理組IL-6、IL-10、TNF-α含量顯著減少(P<0.05)，INF-γ的含量極顯著降低(P<0.01)，花青素+LPS處理組IL-6、TNF-α和INF-γ的含量均顯著降低(P<0.05)，IL-10的含量顯著升高(P<0.05)。

2.2 黑枸杞花青素對(duì)小鼠Raw264.7細(xì)胞炎性相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，花青素處理組IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)降低，IL-10、INF-γ mRNA表達(dá)提高，但差異均不顯著(P>0.05)，LPS處理組IL-6，TNF-α mRNA表達(dá)極顯著升高(P<0.01)，IL-10、INF-γ mRNA表達(dá)顯著提高(P<0.05)，花青素+LPS處理組顯著增加IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)(P<0.05)，IL-10 mRNA表達(dá)極顯著升高(P<0.01)，INF-γ mRNA表達(dá)提高，但差異不顯著(P>0.05)；與LPS組相比，花青素處理組極顯著抑制了IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)(P<0.01)，顯著降低IL-10、INF-γ mRNA表達(dá)(P<0.05)，花青素+LPS組IL-6、INF-γ和TNF-α mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，IL-10 mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。

圖2 黑枸杞花青素對(duì)小鼠Raw264.7細(xì)胞炎性相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響

2.3 黑枸杞花青素對(duì)小鼠Raw264.7細(xì)胞中TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)的影響如圖3所示，與對(duì)照組相比，花青素處理組降低了TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表達(dá)水平，但差異均不顯著(P>0.05)，LPS處理極顯著提高TLR4、NF-κB和MyD88的mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，顯著提高了TRAF6的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，花青素+LPS處理TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)；與LPS組相比，花青素處理組極顯著降低了NF-κB mRNA表達(dá)水平(P<0.01)，顯著降低了TLR4、MyD88和TRAF6 mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，花青素+LPS處理組TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。

圖3 黑枸杞花青素對(duì)小鼠Raw264.7細(xì)胞中TLR4/NF-кB通路關(guān)鍵因子mRNA表達(dá)的影響

2.4 黑枸杞花青素對(duì)小鼠Raw264.7細(xì)胞中TLR4/NF-кB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，花青素處理組極顯著降低TLR4和NF-κBp65 蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，LPS處理極顯著提高TLR4和NF-κBp65 蛋白水平表達(dá)(P<0.01)，花青素+LPS處理TLR4和NF-κBp65 蛋白水平表達(dá)極顯著提高(P<0.01)；與LPS組相比，花青素處理組極顯著降低了TLR4和NF-κBp65蛋白水平表達(dá)(P<0.01)，花青素+LPS處理組TLR4，NF-κBp65 蛋白水平表達(dá)極顯著降低(P<0.01)。

圖4 黑枸杞花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠Raw264.7 細(xì)胞中TLR4/NF-кB通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組對(duì)比，*P<0.05，**P<0.01 ；與LPS處理組對(duì)比，#P<0.05，##P<0.01。下同

圖1 黑枸杞花青素對(duì)小鼠Raw264.7細(xì)胞炎性相關(guān)因子含量的影響

3 討論

巨噬細(xì)胞是參與機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的重要成分，在多種疾病中有效發(fā)揮其吞噬作用，是機(jī)體抵御細(xì)菌感染和癌癥的第1道防線，因此，它們?cè)趩?dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答中扮演著重要的角色并參與自身免疫性疾病、感染和炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制[9]。LPS 為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分,能夠刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的炎癥介質(zhì)(如NO和TNF-α)以及炎性細(xì)胞因子(如IL-1β和 IL-6)，這些物質(zhì)通過(guò)與其他炎癥介質(zhì)的協(xié)同作用促進(jìn)過(guò)敏性哮喘等炎癥性疾病的發(fā)生與發(fā)展[10-12]。TNF-α、 IL-1β、 IL-6 為炎癥反應(yīng)中的主要炎癥因子，是反應(yīng)炎癥水平的重要指標(biāo)[13]。花青素屬于酚類中的類黃酮物質(zhì)，是一類植物中廣泛存在的水溶性天然色素，研究證明，花青素具有抗炎、抗氧化、清除自由基等作用[14-15]。本試驗(yàn)通過(guò)LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7損傷，來(lái)探討黑枸杞花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)的損傷的作用機(jī)制。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，LPS處理組IL-6、TNF-α的含量與mRNA表達(dá)均極顯著升高(P<0.01)，IL-10和INF-γ的含量和mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，與LPS組比較，花青素+LPS處理組IL-6、IL-10、TNF-α和INF-γ的含量和mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。表明黑枸杞花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥具有抑制作用。

Toll樣受體 4(TLR4)是機(jī)體中參與免疫調(diào)節(jié)的重要蛋白分子[16-17]。NF-κB 是炎癥反應(yīng)過(guò)程中重要的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其家族成員主要包括 p65 和 p50[13]。正常生理情況下， NF-κB(p50/p65)以異二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中；在炎癥(如LPS) 刺激條件下， NF-κB 信號(hào)通路被激活后 NF-κB-p65 由細(xì)胞質(zhì)移位至細(xì)胞核，進(jìn)而促進(jìn) TNF-α、 IL-6、 IL-1β、 iNOS 等炎性因子的釋放[18-19]。被 NF-κB 誘導(dǎo)表達(dá)的炎癥因子進(jìn)一步反饋活化 NF-κB，誘導(dǎo) NF-κB 的持續(xù)性活化， 從而加重炎癥損傷[20]。因此，抑制 TLR4 /NF-κB 信號(hào)通路蛋白的活化可能是炎癥治療的作用靶點(diǎn)[21-22]。本研究中，通過(guò)RT-PCR及蛋白免疫印跡試驗(yàn)分別檢測(cè)了TLR4/NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表達(dá)水平及TLR4和NF-κBp65蛋白水平。結(jié)果顯示，與空白組對(duì)比，LPS處理極顯著上調(diào)TLR4、NF-κB和MyD88的mRNA表達(dá)水平及TLR4和NF-κBp65 蛋白水平(P<0.01)，顯著提高了TRAF6的mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，與LPS組對(duì)比，花青素+LPS處理TLR4、NF-κB、MyD88和TRAF6的mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)并且顯著下調(diào)TLR4，NF-κBp65 蛋白水平(P<0.01)。表明黑枸杞花青素對(duì)小鼠Raw264.7細(xì)胞中的TLR4 /NF-κB 信號(hào)通路具有抑制其活化的調(diào)控作用。

綜上所述，黑枸杞花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠Raw264.7細(xì)胞炎癥具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制 TLR4/NF-κB 信號(hào)通路的活化，進(jìn)而抑制促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和INF-γ的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎作用。