組胺抑制自噬流介導SARA奶牛PMN黏附增強

李云飛，李聰宜，楊宇宸，馮獻程，杜希良，李心慰，李小兵，王 哲，宋玉祥，劉國文

(吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

亞急性瘤胃酸中毒(subacute rumen acidosis,SARA)也稱為慢性酸中毒或亞臨床瘤胃酸中毒，是高產奶牛中常見的一種代謝性疾病。GARRET等[1]的研究發現，在美國高達19%的早期泌乳奶牛和26%的哺乳期奶?；加蠸ARA。SARA導致的奶牛產奶量下降、生產效率降低、過早淘汰和死亡等每年所造成的經濟損失高達5億～10億美元[2]。發生SARA時，瘤胃低pH環境會引起瘤胃菌群紊亂，導致革蘭陰性菌(埃氏巨型球菌和大腸桿菌等)死亡和乳酸桿菌中的組氨酸脫羧作用增強，最終導致瘤胃液內內毒素(LPS)和組胺含量急劇上升[3-4]。SARA奶牛胃腸道屏障受損，LPS和組胺入血增加，導致高LPS和組胺血癥，這可能與SARA奶牛系統性炎性反應有關[5]。

PLAIZIER等[5]總結了多個SARA誘導試驗的結果，提出LPS、組胺或其他到達肝臟的細菌產物刺激了急性期反應蛋白從肝臟的釋放并產生全身性炎性反應。SARA奶牛發生系統性炎性反應，是造成多個組織器官功能(肝臟、乳房、胰島和脂肪等)紊亂的病理學基礎，同時與SARA常繼發的蹄葉炎和滑膜炎等無菌性炎癥的發病有關[6]。組胺作為一種炎性介質，可以通過激活細胞表面組胺受體增加嗜酸性粒細胞和中性粒細胞的趨化性，在調節機體免疫反應方面具有重要作用[7-8]。

中性粒細胞(PMN)是機體固有免疫的第1道防線，在血液白細胞中占比最多且最先募集至局部炎癥部位，在炎性信號放大中起著關鍵作用。在健康機體內，PMN處于靜止狀態，但當遇到細菌產物(LPS、組胺等)、細胞因子或趨化因子(TNF-α,GM-CSF,IL-8，IFN-γ等)時，就會引發PMN的活化以及黏附級聯反應的起始[9]。有文獻指出，酸中毒繼發的蹄葉炎和滑膜炎局部組織中PMN浸潤增多且PMN黏附相關蛋白L-選擇素表達增加[10]，說明了由酸中毒引起的PMN活化以及黏附功能的改變。此外，在炎性反應中PMN黏附相關蛋白β2整合素(白細胞功能相關抗原-1(CD11a)和巨噬細胞功能相關抗原-1(CD11b)是中性粒細胞上兩個最豐富的β2整合素，也是主要介導PMN與內皮細胞黏附的主要黏附分子)與其受體的結合對PMN跨內皮遷移到達炎性反應部位至關重要[11-12]。

自噬是哺乳動物細胞內普遍存在的一種能夠實現胞內物質降解和能量循環利用的現象，是調節PMN分化和實現細胞功能穩態的關鍵因素。自噬可通過病原體清除作用、抗原呈遞作用、細胞因子生成和免疫反應等來參與炎性反應的調節[13]。例如：通過敲除NLRP3抑制自噬或抑制NLRP3炎性小體會增強PMN的募集和吞噬作用，從而改善細菌清除率并增加敗血癥小鼠的存活率[14]。此外，自噬在調節細胞黏附方面的作用也越來越多被關注，有研究指出，自噬的活化增加了含β1整合素的囊泡與微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)染色的自噬泡的共定位，但是，自噬的抑制減弱了內在的含β1整合素的溶酶體的降解，減弱了β1整合素在細胞膜表面的重新表達，從而降低了細胞的黏附和遷移速率[15]。

目前，SARA奶牛機體炎性水平增加的內在分子機制尚不清楚。本研究通過SARA奶牛高組胺血癥增強中性粒細胞黏附的角度解釋了SARA奶牛炎性反應增加的原因并部分闡明了其內在分子機制，旨在為奶牛SARA致病機制的研究及其防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物所用實驗動物來源于長春市合隆鎮某集約化奶牛養殖場。隨機選取若干頭胎次相同，體質量相差不大，體況相似，無明顯其他疾病臨床癥狀的經產奶牛。每隔1 h抽取瘤胃液，使用pH試紙檢測瘤胃液pH值，如果瘤胃液pH值低于5.5且持續3 h以上，則確定為SARA奶牛。選取15頭SARA奶牛與15頭健康奶牛作為研究對象。連續10 d記錄產奶量。使用無菌注射器通過乳靜脈抽取以上2組奶牛外周靜脈血50 mL。其中10 mL在離心機上3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，用作生化分析與ELISA試驗，其余40 mL 用作外周血中性粒細胞分離。

1.2 主要儀器與試劑D-37520低溫高速離心機購自德國Thermo Fisher公司；CO2細胞培養恒溫箱購自日本三洋公司；通用型電泳儀購自美國BIO-Red公司；CD11a抗體購自北京博奧森公司；CD11b抗體、LC3A/B抗體、P62抗體均購自美國abcom公司；β-actin抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；組胺(Histamine)、鼠尾膠原蛋白Ⅰ型均購自北京索萊寶公司；氯奎磷酸鹽購自Sigma-Aldrich公司；TNF-α、IL-6、IL-1β、內毒素結合蛋白(LBP)、觸珠蛋白(Hp)和血清淀粉樣蛋白(SAA)ELISA檢測試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司；LPS檢測試劑盒購自廈門鱟試劑生物科技有限公司；組胺ELISA檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；外周血中性粒細胞提取試劑盒購自天津灝洋生物公司。

1.3 血清指標檢測血清LPS檢測使用鱟試劑盒進行檢測，嚴格按照說明書操作。利用人工合成的顯色基質使鱟試劑產生的顯色反應定量檢測內毒素，在適宜的條件下(溫度、pH值及無干擾物質)細菌內毒素會激活C因子并引起一系列酶促反應，激活凝固酶原后形成凝固酶，凝固酶可以分解人工合成的顯色基質，使其分解為多肽和黃色的對硝基苯胺(pNA，λmax=405 nm)，在一定時間內，pNA的生成量與細菌內毒素濃度成正相關。據此，可以定量供試品的內毒素濃度。

血清組胺、血清急性期反應蛋白LBP、Hp、SAA和細胞炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β等采用ELISA檢測試劑盒進行檢測，嚴格根據說明書進行操作。往預先包被抗體的微孔中依次加入樣本和HRP標記的檢測抗體，經溫育并徹底洗滌，用底物TMB顯色。TMB在酶催化下轉化為藍色，在酸的作用下變為黃色，顏色的深淺與樣品中的待檢測指標成正相關，用酶標儀在450 nm波長下檢測吸光值，根據標準曲線計算樣品濃度。

1.4 外周血中性粒細胞分離試驗采用中性粒細胞提取試劑盒提取外周血中性粒細胞。其分離原理為密度梯度離心。在離心管內依次緩慢加入2∶1含量的不同懸浮密度的A液和C液，使其形成分離液面，然后加入同體積的新鮮抗凝血液，室溫下800 r/min 離心30 min，取中性粒細胞層到離心管內，加入洗滌液，搖勻，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清后加入紅細胞裂解液重懸，10 min后1 000 r/min 離心10 min，棄掉上清后用RPMI-1640培養基洗滌2次，提取出中性粒細胞后進行黏附試驗或免疫印跡試驗；體外試驗用RPMI-1640培養基適應培養2 h，然后給于刺激物刺激后收集細胞進行黏附試驗或免疫印跡試驗。

1.5 中性粒細胞黏附試驗提前在96孔板的孔內加入50 μL 0.012 g/L用乙酸稀釋溶解的Ⅰ型鼠尾膠原蛋白，在超凈臺內過夜晾干，使96孔板底部包被上Ⅰ型鼠尾膠原蛋白。分離出牛外周血中性粒細胞后，調整細胞為2×106個 /mL，向預先包被了Ⅰ型鼠尾膠原蛋白的培養孔內加入100 μL細胞懸液，37℃、5%CO2細胞恒溫箱內培養4 h，用冷PBS溶液清洗3次，洗去未黏附的細胞，然后加入100 μL PBS，使用相差顯微鏡(400×)觀察，隨機選取視野拍照，并在相同大小面積內計算黏附的中性粒細胞數量。

1.6 蛋白免疫印跡試驗分離出中性粒細胞后用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養平衡2 h，調整細胞為2 ×106個/mL，用6孔板培養，每孔3 mL，分組為空白組、組胺(10 μmol/L)組、氯奎(100 μmol/L)組、組胺+氯奎組，刺激4 h后收集細胞，用冷PBS緩沖液清洗2遍，用含有1%蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解細胞10 min，然后12 000 r/min離心10 min，棄掉沉淀，使用BCA法檢測蛋白濃度，調整蛋白濃度后加入蛋白上樣緩沖液，95℃加熱5 min使蛋白變性，配置12% SDS-PAGE分離膠，按每孔30 μg蛋白上樣，80 V電泳2 h，后通過濕轉法將蛋白電轉至PVDF膜上，用3% BSA溶液常溫封閉3 h，封閉后將膜浸沒與1∶1 000稀釋的一抗中，4℃封閉過夜，用TBST溶液清洗3遍后，常溫孵育二抗45 min，用TBST溶液清洗3遍后，在顯影儀上檢測蛋白表達量。

2 結果

2.1 健康奶牛和SARA奶牛血清生化指標檢測通過對比健康奶牛和SARA奶牛的生產性能發現，相對于健康奶牛，SARA奶牛的日均產奶量有明顯的下降(表1)；SARA奶牛血液中葡萄糖和β-烴丁酸(BHBA)的濃度雖然有輕微增加但并沒有統計學上的明顯差異(表1)；血液生化指標結果顯示，相比于健康奶牛，SARA奶牛血清LPS的含量從不可檢測升高到了0.22 EU/mL左右，而組胺濃度從平均1.12 μmol/L增加到了6.32 μmol/L(表1); SARA奶牛血清免疫學指標中, 急性期反應蛋白LBP、Hp和SAA的濃度顯著性增高(表1)，TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎因子或趨化因子均顯著性升高(表1)。以上結果表明，SARA奶牛存在高LPS和組胺血癥以及系統性炎性反應。

表1 健康和SARA奶牛相關血液指標

2.2 健康和SARA奶牛中性粒細胞黏附能力和黏附蛋白表達檢測為了探究發生SARA時血液中PMN的黏附功能變化，本研究檢測了SARA奶牛PMN的黏附功能和主要相關黏附蛋白的表達變化。通過黏附試驗發現，發生SARA的奶牛其PMN黏附數量明顯多于健康奶牛(圖1A)， 黏附細胞數量約增加了0.5 倍(P<0.01)(圖1B)；通過Western blot試驗檢測了PMN主要相關黏附蛋白的表達水平，結果顯示與健康奶牛相比，發生SARA的奶牛主要相關黏附蛋白CD11a和CD11b表達顯著性升高(圖1C)，CD11a的表達量約為健康組奶牛的1.5倍(P<0.01)(圖1D)，而CD11b約為健康奶牛的4倍(P<0.01)(圖1E)。綜上所述，奶牛發生SARA時，外周血中性粒細胞黏附增強，主要相關黏附蛋白表達增多。

A.中性粒細胞黏附能力檢測(400×);B.A中黏附的中性粒細胞數定量分析;C.中性粒細胞主要黏附分子CD11a和CD11b的免疫印跡結果;D.C中的黏附分子CD11a的相對表達水平;E.C中的CD11b的相對表達水平

2.3 SARA奶牛中性粒細胞自噬流檢測自噬參與了細胞的多種生理性功能，為了解奶牛在發生SARA時PMN的自噬水平，本研究通過Western blot試驗檢測SARA奶牛與健康奶牛PMN自噬流情況。結果如圖2A所示，與健康奶牛相比，SARA奶牛PMN內LC3-I向LC3-II的轉變有明顯增加，但LC3-II在胞內并未被迅速降解而是在細胞內累積(P<0.05)(圖2B)。與此同時，自噬降解底物 P62在SARA奶牛PMN內累積升高(P<0.05)(圖2C)。綜上所述，奶牛發生SARA時中性粒細胞自噬過程受阻，自噬降解過程在一定程度上減弱即自噬流被阻斷。

A.SARA奶牛和健康奶牛中性粒細胞相關自噬標記分子蛋白免疫印跡圖；B.LC3-II/LC3-I蛋白的相對表達水平;C.P62蛋白的相對表達水平

2.4 組胺通過阻斷PMN自噬流引起PMN黏附增強為了探明奶牛發生SARA時引起PMN功能改變的具體影響因子，本研究分離了健康奶牛的外周血PMN，在體外給于病理濃度的LPS和組胺，對比兩者對PMN的黏附和激活作用。黏附試驗結果顯示，給予病理濃度(7 μmol/L)的組胺刺激4 h后，PMN的黏附數量顯著性增加，而病理濃度(0.4 EU/mL即0.04 μg/L)的LPS并沒有引起顯著性的黏附變化(圖3A)。單獨組胺刺激與組胺和LPS共同刺激均引起了中性粒細胞的黏附增強(P<0.01)，而LPS與對照組并沒有顯著性差異(P>0.05)(圖3B)。說明奶牛發生SARA時由瘤胃進入外周血的高濃度組胺引起了中性粒細胞黏附狀態的改變。為了證明自噬流在組胺引起的PMN黏附增強中的作用，本研究通過使用自噬流阻斷劑氯奎(CQ)來研究PMN自噬與細胞黏附之間的關系。黏附試驗結果發現，通過CQ阻斷自噬流后，與對照組相比發生黏附的PMN數量明顯增加(圖3C)，其增強PMN黏附能力的作用(P<0.01)甚至要高于組胺的刺激作用(P<0.01)(圖3D)。綜上所述，組胺增強中性粒細胞黏附能力的作用是由自噬流抑制所介導的。

3 討論

SARA是一種常見的奶牛代謝性疾病，給奶牛生產養殖業造成了巨大損失[2]。SARA會造成奶牛多個器官或組織功能紊亂，嚴重影響奶牛產奶量、乳品質和繁殖率，每年因SARA造成的經濟損失高達5億～10億美元[2]。本研究結果發現SARA奶牛與健康奶牛相比，平均日產奶量有明顯下降(表1)。GOZHO等[6]研究結果證實在泌乳中期的奶牛中，谷物誘導的SARA會增加革蘭陰性細菌的溶解并激活奶牛系統性炎性反應。SARA奶牛血液組胺和LPS水平升高可以激活肝臟常駐巨噬細胞——庫否細胞，進而通過NF-κB信號通路和JNK-AP1信號通路促進轉錄因子NF-κB和AP-1的入核和下游促炎因子(如TNF-α、IL-1和IL-6等)的表達和分泌導致肝臟炎性反應增加和肝損傷。肝損傷會進一步促進急性期反應蛋白如CRP、SAA和Hp等的分泌入血，引起一定程度的系統性炎性反應。SAA與Hp由肝臟合成，他們與LBP常被用作系統性炎性反應特別是乳腺炎的指標[16-17]。在GOZHO等[6,18]的研究中，利用不同的方法誘導奶牛SARA后，發現血清淀粉樣蛋白A(SAA)和觸珠蛋白(Hp)濃度顯著性增加，這與本研究結果一致。此外，SAA的合成可以通過IL-6或TNF-α的釋放來誘導，但是要合成觸珠蛋白，這2種細胞因子都是必需的[16]。本研究結果顯示，與SAA在血清中的增高相一致，SARA奶牛血清中的IL-6和TNF-α也有顯著性升高，而且，細胞趨化因子IL-1β的含量也隨之增高。以上結果證實了奶牛發生SARA時，血清中主要急性期蛋白與炎性細胞因子分泌增加，說明了奶牛機體內出現了炎性反應，并且奶牛的生產性能受到了影響。

A.0.04 μg/L LPS或7 μmol/L組胺刺激4 h后中性粒細胞黏附能力檢測(400×);B.A中黏附的中性粒細胞數定量分析;C.通過100 μmol/L氯奎抑制PMN自噬流或組胺刺激后中性粒細胞黏附能力檢測(400×);D.A中黏附的中性粒細胞數定量分析

圖3 體外自噬與黏附關系的探究

奶牛發生SARA時，胃腸道屏障功能受損，胃腸內由細菌產生的LPS和組胺等會滲透進入血液，引起奶牛的免疫細胞活化，同時引起機體的炎性反應水平增加。NOCEK等[19]證實，SARA奶牛機體升高的炎性反應水平不僅僅是由于血液中升高的LPS，組胺的易位可能是導致炎癥水平增加的主要原因。本研究結果證實，奶牛發生SARA時其外周血中的LPS和組胺濃度升高。但是，在病理濃度的LPS或組胺作用下，組胺引起了PMN黏附能力的改變，LPS并沒有引起這些變化，這可能是由于肝臟對于LPS的屏障作用導致血液中的LPS(0.4 EU/mL=0.04 μg/L)不足以引起免疫細胞的活化。ANDERSEN等[20]甚至在SARA奶牛外周血中沒有檢測到LPS的存在。而SARA時瘤胃內升高的組胺則通過NF-κB途徑誘導了牛瘤胃上皮細胞的炎癥反應[21]。以上證據說明SARA奶牛機體內炎癥水平的增加以及PMN黏附能力的改變主要由血液中升高的組胺引起。

PMN是最常見的白細胞類型，是最先到達炎性反應部位的免疫細胞，在調節機體炎性反應水平方面具有重要作用，其功能的改變往往與機體炎性反應有關。數據表明，奶牛發生SARA時，瘤胃內左旋乳酸升高入血，可誘導PMN通過NET依賴性機制黏附于血管內皮細胞[22]。本研究結果發現，SARA奶牛PMN黏附能力較之于健康奶牛有明顯升高。介導PMN與內皮細胞黏附的CD11a和CD11b蛋白的水平增加，這或許與SARA奶牛炎性反應水平有關，因為在正常情況下，PMN處于靜止狀態，其與內皮細胞的黏附處于較低水平，發生SRAS時PMN被免疫原性物質激活，啟動了黏附級聯反應，活化的PMN就會與血管內皮細胞發生黏附，導致組織浸潤增加，并分泌炎性因子，引起奶牛機體的炎性反應。此外，PMN的自噬功能在影響細胞功能方面的作用也越來越多的被報道。本研究探索了SARA奶牛PMN的自噬狀態，通過Western blot檢測自噬相關蛋白LC3和P62的表達水平。在自噬過程中，p62與LC3結合并優先被自噬體溶酶體降解。但本研究發現作為自噬流早期水平的標志性分子LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉變顯著性增加，但是，LC3-II和作為自噬降解底物的P62卻在細胞內累積,說明SARA奶牛自噬的過程受到了阻斷。以上結果說明，奶牛發生SARA時，外周血PMN功能發生了改變，具體表現為黏附能力增強，黏附相關蛋白表達增多，自噬流被阻斷，自噬降解過程受阻。

細胞的內吞作用和膜蛋白的循環作用有助于調節細胞的黏附與遷移，整合素是參與細胞與細胞外基質(ECM)之間相互作用的黏附分子家族，在PMN上介導PMN與內皮細胞的牢固黏附，整合素可通過細胞內吞作用實現從細胞膜到胞內囊泡的轉運,囊泡內的整合素可以與溶酶體結合實現整合素的清除或降解為小分子物質重新用于合成整合素[23]。VéRONIQUE等[15]的結果顯示抑制HeLa細胞的自噬后，細胞的內吞作用和膜循環作用減弱，β1整合素的降解過程受阻，β1整合素在細胞膜表面的重新分布增多，細胞黏附與遷移增多。在本研究中，利用氯奎(CQ)抑制了中性粒細胞自噬降解過程，其黏附能力顯著性增強。以上結果說明，中性粒細胞自噬降解受抑制后，細胞的內吞作用和黏附蛋白的膜循環作用受到干擾，引起黏附分子的降解作用受阻，黏附分子在細胞膜上累積，引起細胞黏附能力的升高。

綜上所述，本研究證實了奶牛發生SARA時，奶牛機體系統性炎性反應水平增加，是SARA影響奶牛生產性能的重要因素。 并進一步證明了SARA引起的系統性炎性反應與高組胺血癥抑制自噬流導致的PMN黏附和活化增強有關。本研究結果可為SARA奶牛致病機制研究和防治產品研發提供理論依據。