朝藿定A對原代骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化的作用

劉 穎，柴麗娟，黃菊陽，王 琴，宋 蕾，周 昆*，李云章*

(1.內蒙古農業大學 獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.天津中醫藥大學 中醫藥研究院 天津市中藥藥理重點實驗室，天津 300193)

淫羊藿是中國傳統中藥，《本草綱目》中記載其功效為益精氣,堅筋骨,補腰膝等，研究顯示淫羊藿可顯著改善骨代謝[1]，淫羊藿提取物可以減少卵巢切除或老化大鼠模型的骨質流失，但其作用機制仍不清楚[2]。淫羊藿中朝藿定A、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、朝藿定B、朝藿定C等黃酮類成分含量較高并具有較強生理活性[3]。BMSCs是一種源自中胚層的干細胞，能夠在骨髓和各種器官的血管周圍進行自我更新和多向分化，并在骨骼、皮膚、肝臟和肌肉等組織的再生中發揮重要作用。它可以在體外分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞。BMSCs由于其自我更新和多向分化以及易于獲取而廣泛用于細胞治療和組織工程中。BMSCs的數量保持在較高水平可以減緩骨質疏松的病程，將BMSCs移植到受損部位，分化為成骨細胞可以直接逆轉骨質流失。因此，BMSCs細胞移植是治療骨質疏松的重要手段，但其療效的確定性和穩定性引起極大爭議，因此藥物干預BMSCs治療骨質疏松已成為一個熱門的研究課題。本研究旨在研究淫羊藿提取物朝藿定A對原代BMSCs向成骨細胞的分化能力，以探討淫羊藿對改善骨質代謝的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周雌性 C57BL/6J 小鼠，SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。許可證編號：SCXK(京)2016-0004。動物飼養于天津中醫藥大學實驗動物房。

1.2 主要試劑α-MEM培養基、胎牛血清 (fetal bovine serum，FBS)、青鏈霉素混合液、trypsin-0.25%EDTA(Gibco)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)&抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistantacidphosphatase，TRACP)檢測試劑盒(Takara)；MSCgoTM間質干細胞成脂誘導分化培養基(BI)；朝藿定A(成都普菲德)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、10%氯化十六烷基吡啶、0.1%茜素紅-Tris-Hcl(PH 8.3)(索萊寶)；二甲基亞砜(Amresco)；ALP染色試劑盒(南京建成)；β甘油磷酸鈉、維生素C(Vc)、雌二醇(E2)和地塞米松(Sigma)。

1.3 主要儀器多功能讀板機(Felex station 3，MD，美國)；超聲破碎儀(VCX 130，Sonics,美國)；倒置熒光顯微鏡(TE300，Nikon，日本)；超凈工作臺(蘇凈安泰，中國)；CO2培養箱(Thermo，美國)；小型臺式離心機(Beckman，美國)；臺式冷凍離心機(Beckman，美國)；氣浴搖床(Stuart，S1500，英國)；天平(Sartorius，德國)。

1.4 BMSCs的分離與培養拉頸法處死小鼠，于75%酒精中浸泡消毒5 min，在超凈臺分離小鼠后肢長骨，去除骨表面軟組織和骨骺，置入盛有PBS(1%雙抗)的玻璃皿中。用針筒吸取完全培養基(90%α-MEM，10%FBS，1%青鏈霉素，簡稱全培)，反復沖洗骨髓腔和骨內表面，直至骨壁變白。骨髓懸液用70 μm細胞篩過濾，將過濾后的細胞懸液均勻接種至25 cm2培養瓶中，CO2培養箱37℃，5%CO2培養。72 h后棄去未貼壁細胞和培養基，換成新鮮全培，此后每周換液2～3次，至細胞鋪滿90%后傳代。

傳代方法：棄上清，用PBS清洗細胞，加入1 mL trypsin-0.25% EDTA，室溫放置1 min，顯微鏡下觀察細胞出現皺縮脫落時，加入全培終止消化，用1 mL 移液器吹打細胞，至細胞脫壁，收集細胞懸液至50 mL離心管，1 000 r/min，4℃離心5 min。棄上清用適量全培重懸細胞，以1∶2或1∶3進行傳代。BMSCs傳至第3代，調節細胞濃度至5×105個/mL，將細胞懸液接種到96孔板，待細胞長滿。

1.5 成骨細胞的誘導分化及檢測空白對照Con1繼續用全培培養，其他組換成成骨誘導培養基(含β-甘油磷酸鈉10 mmol/L,Vc 0.05 mmol/L和地塞米松100 nmol/L的全培)繼續培養。設朝藿定A給藥濃度分別為0.01,0.1和1 μmol/L(記為AL、AM、AH)；陽性對照給予雌二醇(Estradiol,E2)，濃度為1 μmol/L；對照Con2給予0.1%DMSO。培養3 d后，對細胞進行ALP染色；上述方法培養7 d后吸取50 μL細胞上清液，檢測OPG、RANKL 水平；上述方法培養10 d后，對細胞進行礦化染色，拍照后，溶解礦化結節，測D562 nm值。以上3組檢測所用細胞來自不同批次分離的BMSCs。

1.6 成脂細胞的誘導分化BMSCs傳至第3代，細胞長滿后將培養基吸除，每孔加入0.5mL含藥成脂誘導分化培養基，朝藿定A給藥濃度分別為0.01,0.1和1 μmol/L (記為AL、AM、AH)；陽性對照給予E2，濃度為1 μmol/L；對照Con2給予0.1%DMSO，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，每3～4 d換液，直至觀測到成熟脂肪細胞(即脂滴的形成)，約10 d。將脂肪細胞用油紅O染色，溶解后測D500 nm值。

2 結果

2.1 朝藿定A對BMSCs誘導分化形成成骨細胞的影響

2.1.1朝藿定A對BMSCs ALP表達的影響 結果見圖1。細胞中的ALP被染成褐色。與Con1相比，成骨誘導后的Con2分泌了更多ALP；與Con2組相比，各給藥組ALP表達均有增多。

A.Con1；B.Con2；C.E2;D.AL;E.AM;F.AH

2.1.2朝藿定A對BMSCs 分化形成礦化結節的影響 結果見圖2。細胞培養板中的礦化結節被染成紅色。與Con1相比，成骨誘導后的Con2沒有形成更多礦化結節；與Con2組相比，各給藥組礦化結節均顯著增多(P<0.05，P<0.01)。

圖2 朝藿定A對BMSCs 分化形成的成骨細胞礦化結節的影響

2.1.3朝藿定A對BMSCs分化成骨細胞上清中OPG/RANKL的影響 結果見圖3。給予E2和0.01 μmol/L 朝藿定A時，上清中OPG水平顯著升高(P<0.05)，其他給藥組也有上升趨勢；給予E2和0.1 nmol/L朝藿定A時，RANKL水平呈上升趨勢；而給予1,100 μmol/L朝藿定A時，RANKL水平呈下降趨勢。從OPG/RANKL的結果來看，給予E2和0.1 nmol/L朝藿定A時OPG/RANKL值較對照組顯著升高，而其他劑量組也有上升趨勢。

圖3 朝藿定A對BMSCs細胞上清中OPG/RANKL的影響

2.2 朝藿定A對BMSCs誘導分化形成成脂細胞的影響結果見圖4。細胞培養板中的脂肪滴被染成紅色。與Con相比，朝藿定A低劑量(0.01 μmol/L)組成脂分化的程度沒有明顯變化；朝藿定A高劑量(1 μmol/L)組成脂分化較對照組顯著降低(P<0.05)。

圖4 朝藿定A對BMSCs 分化形成脂肪細胞的影響

3 討論

成骨細胞和骨細胞源于間充質干細胞，間充質干細胞是一種多能細胞，最先從骨髓中發現，有分化為成骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、神經細胞和軟骨細胞的潛能。成骨細胞被鈣化的骨膠原基質包圍。這些細胞呈樹突狀伸展，可以與破骨細胞和骨細胞更靈活地聯系起來。體外培養的BMSCs經過誘導可分化為成骨細胞，采用BMSCs定向成骨分化是愈合困難的骨折修復的主要方法，BMSCs作為骨組織工程重要的種子細胞來源[4-5]，在臨床上應用廣泛。

訾慧等[6]采用淫羊藿苷對BMSCs成骨性分化的影響研究發現，淫羊藿苷可以提高骨組織中的骨鈣素，增加ALP的含量，促進 BMSCs的增殖和分化。本研究中，朝藿定A給藥3 d后，發現成骨誘導后的Con2分泌了更多ALP，證實朝藿定A對BMSCs的成骨分化有促進作用。在朝藿定A給藥14 d 后，用茜素紅染色法檢測成骨細胞礦化結節的形成，發現各給藥組礦化結節均顯著增多，表明朝藿定A對BMSCs分化成的成骨細胞鈣沉積有促進作用。朝藿定A給藥10 d后，用油紅O染色法檢測BMSCs成脂分化程度。結果顯示，朝藿定A低劑量組成脂分化的程度沒有明顯變化，而高劑量組成脂分化較對照組顯著降低，可見朝藿定A對BMSCs成脂分化在1 μmol/L劑量下有一定的抑制作用。

RANKL可以與其受體，在破骨細胞和其前體上的成骨細胞表達核轉錄因子κB的受體活化劑相連[7]。骨細胞的凋亡促進成骨細胞表達RANKL，它與破骨細胞上的同源受體相連[8]。破骨細胞的主要作用是骨吸收，這些多核細胞來源于造血細胞系，通過單核祖細胞的融合形成，如單核細胞和骨髓巨噬細胞。RANKL與其受體的結合導致單核祖細胞分化融合成多核破骨細胞。破骨細胞的活力在常態和大部分病理情況下與骨吸收的增加有關。OPG是一種誘導肽，由成骨細胞和成骨基質干細胞分泌，通過清除RANKL來減少與核因子κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κ B，RANK)的結合，從而抑制過多的骨吸收[9]。因此，無論正常或疾病狀態下，骨髓中的RANKL/OPG率是骨質量的重要決定因素[10]。

骨吸收的各種刺激因子可作用于成骨細胞或骨髓基質細胞，誘導成骨細胞上的RANKL表達，旁分泌OPG。RANKL和OPG與位于破骨細胞前體細胞膜上的RANK受體競爭性相互作用[11]。結合后，將相應的信號引入破骨細胞前體細胞中以促進破骨細胞分化，增強成熟破骨細胞的活力，并防止破骨細胞凋亡。骨組織微環境中OPG和RANKL表達的相對水平(OPG/RANKL)是決定破骨細胞形成和活性的關鍵[12]。如果OPG的表達水平高于RANKL，則破骨細胞受到抑制并且骨量增加；反之，破骨細胞形成活躍，導致骨量減少。OPG/ RANKL/RANK調節破骨細胞的分化和成熟，促進或抑制破骨細胞的凋亡，并調節骨代謝的穩態。該系統對于骨質疏松癥等骨丟失相關疾病具有重要意義。

何丹丹等[13]發現，淫羊藿苷脫糖物淫羊藿素可以與RANKL靶點結合,從而抑制破骨細胞增殖。另外一項對淫羊藿苷的研究發現，淫羊藿苷可抑制RANKL與RANK的結合，上調OPG/RANKL比值，從而降低破骨細胞的增殖和分化，達到降低骨吸收的作用[14]。本研究中，通過細胞上清OPG和RANKL檢測，發現給予E2和0.01 μmol/L朝藿定A時，上清中OPG水平顯著升高，其他給藥組也有上升趨勢；給予E2和0.1 nmol/L朝藿定A時，RANKL水平呈上升趨勢；而給予1，100 μmol/L朝藿定A時，RANKL水平呈下降趨勢。從OPG/RANKL的結果來看，給予E2和0.1 nmol/L朝藿定A時OPG/RANKL值較對照組顯著升高，而其他劑量組也有上升趨勢。證明朝藿定A促進BMSCs向成骨細胞分化可能也是通過OPG/RANKL通路實現的。

綜上所述，朝藿定A可以促進BMSCs細胞向成骨細胞分化并抑制其成脂分化，可以促進成骨細胞礦化并提高成骨細胞OPG/RANKL水平從而發揮骨保護作用。