高原肉雞肺動脈平滑肌細胞的分離、鑒定及低氧對其增殖的影響

常振宇,董海龍 ,李家奎,吳慶俠*

(1.西藏農牧學院 動物科學學院，西藏 林芝860000;2.華中農業大學 動物醫學院，湖北 武漢430070)

肉雞肺動脈高壓綜合征 ( pulmonary arterial hypertension，PAH) 是由多病因所致的一種以肺動脈壓力增高為特點的疾病或綜合征，主要通過血管收縮、肺血管重構來誘發右心衰竭，直至腹水死亡[1]。肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)位于肺動脈血管內皮細胞下層，參與多種病理反應的發生發展過程，如高原缺氧、肉雞腹水肺動脈高壓綜合征、自由基損傷、動脈粥樣硬化等[2-4]。另外，肉雞肺動脈血管內膜及中膜PASMCs的增殖、肥大可以誘導低氧性肺血管收縮和血管重構，且肉雞PAH綜合征形成過程中具有這一特征，國內外學者研究發現低氧應激在PAH血管重構中發揮關鍵作用[5-8]。因此探討研究肺血管重構機制的關鍵環節就是體外培養PASMCs，因此需要建立PASMCs培養方法。雖然國內外關于人、鼠和豬等哺乳動物的PASMCs培養方法已建立培養體系，但目前有關高原缺氧條件下肉雞PASMCs的體外培養的研究少有報道[9-11]。肉雞PASMCs培養方法主要有組織貼塊法和酶消化法兩種，但酶消化法步驟繁瑣，酶消化時間難掌控，所需膠原酶價格昂貴不經濟，所需成本較高[12-15]。近年來的研究開始以PASMCs作為細胞模型來探討PAH的分子機制[16]。本試驗以高原肉雞肺主動脈組織作為來源，通過N2誘導低氧條件下培養，并采用組織貼塊培養法更為穩定可靠，為在體外細胞培養條件下研究低氧對PASMCs 增殖的機制提供參考，并為研究缺氧--肺血管重構--PAH發病機制及其他相關研究提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物1日齡的健康AA肉雞10只。

1.2 主要試劑PBS液(現用現配)；胰蛋白酶、100 U/mL 青霉素和100 g/mL鏈霉素(武漢谷歌生物有限公司)；胎牛血清(Gibco，四季青公司)；D-Hank's液(武漢谷歌生物有限公司)；DMEM/F12培養基(Gibco，四季青公司)；2%臺盼藍試劑(Sigma)；滅菌載玻片、DMSO(Sigma-Aldrich)；L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)；鼠抗平滑肌肌動蛋白單克隆抗體ACTA-2(武漢博士德公司)。

1.3 主要儀器倒置顯微鏡(BX435)；厭氧培養箱(SHELLAB)；超凈工作臺(JT-B型)

1.4 PASMC原代培養采用空氣靜脈注射法處死肉雞，解剖剪剪開胸腹部，滅菌鑷子、剪刀等無菌取出肉雞肺動脈，并將肺動脈浸入D-Hank's液，分離細胞之前將肉雞肺動脈放于冰上。在無菌操作臺上將肺動脈放入150 mm×25 mm Petri 培養皿中，用解剖剪沿長軸剪開肺動脈，用手術刀片輕輕刮去動脈內腔面，去除內皮細胞，用D-Hank's 液反復沖洗。用解剖剪將中膜剪成約1 cm2的組織塊，放入60 mm×15 mm Petri培養皿，內膜側朝下，讓組織塊貼壁約10 min，并在組織塊上注入1 mL DMEM/F12。將組織塊放入飽和濕度的培養箱，在37℃和體積分數5% CO2條件下培養。第2天加入5 mL DMEM/F12，沿壁緩慢加入。繼續培養，每日觀察，待組織液變黃時，換液。同時用顯微鏡觀察細胞的生長情況，待細胞生長接近單層時，用0.25% 胰蛋白酶和 EDTA 混合液傳代。

1.5 PASMC傳代培養待原代培養的PASMCs生長融合到培養皿面積的80%以上時即可進行傳代。吸棄原培養液，用D-Hank's 液沖洗。以 0.02% EDTA和 0.05% 胰蛋白酶室溫下進行消化5～7 min，觀察細胞出現縫隙但未浮起時，吸棄消化液。加入5 mL含5%胎牛血清，吹打10余下并將細胞制成均勻的混懸液，注意吹打時不可過于猛烈，盡量避免氣泡出現，將細胞液接種到新的培養瓶中培養，待細胞長滿皿底 80% 時按上述方法依次傳代。

1.6 PASMC免疫組化鑒定將第 4 代傳代細胞用固定液(4%多聚甲醛)固定50 min，PBS溶液清洗3次，0.5% Triton X-100孵育15 min，PBS 清洗3～4次。3% 雙氧水(H2O2)孵育10 min，PBS 清洗3～4次。滴加1∶100 鼠抗平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(ACTA-2)，過夜。PBS清洗3～4次，山羊抗兔HRP- IgG為二抗，孵育，按說明書進行二氨基聯苯胺法顯色操作，梯度酒精脫水、透明和封片。應用 Olympus 光學顯微鏡進行觀察并拍照。

1.7 低氧培養PASMCPASMCs消化后分為常氧組和低氧組培養。常氧組為正常氧濃度培養，而低氧組持續低流量通入氮氣，通過數字監控器控制氧濃度為1.0%。

1.8 生長曲線的測定試驗采用第 4 代細胞，96孔板中接種PASMCs約103個/孔，分為常氧組和低氧組，每組設6個復孔分別在常氧和低氧條件下培養 0，4，8，12，24，48和72 h 后，取出培養板，每孔加入100 μL 含有10 μL CCK-8溶液的 DMEM/F12 培養基，37 ℃繼續孵育2 h，檢測 425 nm 處的D值。并繪制生長曲線，縱坐標為細胞數，橫坐標為培養時間。

2 結果

2.1 藏雞PASMCs的生長情況培養后4 d在倒置顯微鏡下可見少量細胞從組織塊周圍呈放射狀爬出，放射狀排列，PASMCs呈長梭形或三角形，爬出的細胞形成細胞簇，細胞形狀多不規則，形態不清晰(圖1A)。7 d后長成細胞單層，鄰近組織塊的細胞密集，胞體較小，形態仍不清晰(圖1B)。本試驗培養的藏雞 PASMCs 在體外可傳 5～7代。

2.2 藏雞PASMCs的鑒定

2.2.1藏雞PASMCs形態學觀察 通過倒置顯微鏡下觀察，PASMCs細胞呈長梭形或三角形，放射性生長，成簇的PASMCs細胞平行排列，高低起伏(圖2A);培養4 d呈現平滑肌細胞特有的“峰-谷”狀(圖2B)。

A.倒置顯微鏡下PASMCs形態；B.培養4 d PASMs呈平滑肌細胞特有的“峰-谷”狀

2.2.2免疫組化鑒定 免疫組化結果表明，藏雞肺動脈平滑肌細胞的ACTA-2單克隆抗體免疫組化結果呈現陽性反應，染色可見胞漿染成棕紅色，胞核位于細胞中央，高倍鏡下可見胞漿內有明顯的細絲(圖3)。計數 100 個細胞，肺動脈平滑肌細胞的染色陽性率超過95%。

圖3 藏雞PASMCs的ACTa-2免疫組化染色鑒定(×400)

2.3 常氧與低氧組 PASMCs 形態差異PASMCs分別于常氧和低氧下培養，培養4 d后結果如圖4所示，常氧下PASMCs正常穩定生長，細胞形態呈長梭形或多角形，細胞比較圓潤。低氧下PASMCs數量變少，細胞變細變長，且間隙增大。

A.常氧條件下培養4 d的藏雞原代PASMCs (×200);B.低氧條件下培養4 d的藏雞原代PASMCs (×200)

2.4 常氧與低氧組PASMCs的生長曲線如圖5所示，CCK-8法檢測PASMCs生長曲線，常氧組和低氧組PASMC的D值隨時間的增加而增高。但整體D值常氧組(1.462±0.253，n=8)顯著高于低氧組(0.844±0.047，n=8)，常氧組PASMCs生長較低氧組快，增殖速度也明顯。

圖5 PASMCs 在常氧與低氧條件下生長曲線圖與低氧組比較

3 討論

PAH又稱肉雞腹水綜合征，是家禽發生的一種以缺氧、腹部膨大、不愿運動、肺動脈壓力升高及右心衰為特點的綜合征。肉雞肺動脈高壓是以肺動脈壓血管重構為特征的一組疾病，且眾多研究揭示肺血管重構是其中心環節之一，PAH的主要病理變化是血管壁重構、血管收縮及原位血栓的形成，其中PASMCs增殖是血管壁重構的關鍵環節。目前所有在體實驗均證實，肺血管重構是肉雞低氧性肺動脈高壓不可逆轉的關鍵因素和血管變化特征，其主要病理變化是低氧可以刺激PASMCs異常增殖，并誘發PAH[17-18]，但缺氧條件下其發生的機制尚未了解，體外細胞培養結果卻不一致[19]。低氧是導致肺動脈高壓的一個關鍵因素，體外原代分離培養細胞可以排除眾多因素干擾，也可以模擬體實驗結果，本試驗通過組織貼壁法，采用低氧培養箱體外培養PASMCs的方法成功模擬低氧模型，利用ACTA-2鑒定第4代PASMCs，并通過觀察低氧對PASMCs增殖的情況，探討低氧性肺動脈高壓的發病機制。

平滑肌細胞體外培養典型的特征是細胞呈長梭形或三角形，并有典型的“峰-谷”狀外觀。本方法培養的細胞符合這一形態特征，另外經免疫組化方法對平滑肌特異性的ACTA-2 抗體檢測結果呈陽性，表明所培養的細胞是肉雞PASMCs。本試驗采用改良貼壁法獲得的 PASMCs方法簡便，且細胞純度和狀態均符合實驗條件，為研究肺循環疾病相關病理機制和防治提供了較好的實驗條件，并為探索肺循環疾病的病理機制尋找防治疾病的新靶點和藥物提供實驗條件。

本試驗通過在細胞培養條件基礎上去探討常氧和低氧條件對高原肉雞PASMCs的影響，可以忽略神經體液等的影響，更直觀的闡明低氧對PASMCs的直接影響。有研究發現低氧能夠抑制犢牛PASMCs的增殖[20-21]；也有人認為只有預先用佛波酯(PMA)激活蛋白激酶C，低氧條件下培養的 PASMCs 數目才會顯著增加，且低氧不能直接誘導體外培養的PASMCs 增殖[22-23]；徐敦全等[24]認為雌激素會顯著降低低氧條件下 PASMCs 的增殖。DEMPSEY等[22]發現，在同條件下的低氧環境中，貓肺動脈平滑肌血管內徑在200～600 μm收縮明顯，而血管內徑大于800 μm收縮不顯著，造成此現象主要是由于PASMCs的肌球蛋白輕鏈對低氧的刺激不發生磷酸化而導致。本試驗顯示低氧培養不同時間點，PASMCs的增殖情況有較大差異，相對于常氧培養，短期低氧并不會改變PASMCs的生長狀況，而長時間低氧培養對PASMCs的增殖并沒有促進作用。

總之，本試驗成功進行了藏雞PASMCs的分離、培養及鑒定，建立了體外培養條件下穩定傳代的PASMCs體系，通過探討低氧對其增殖的影響，為進一步研究禽類心血管系統疾病及其他方面的應用提供了重要的試驗材料和參考依據。