金黃色葡萄球菌乙?；D移酶抑制巨噬細胞胞外誘捕網的形成

周程鍇，劉真真，高 宇，毛橋虹，楊勇軍，陳 巍

(吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)廣泛感染人和動物，是重要的人獸共患病病原菌，嚴重影響養殖業的發展和危害人類的健康。金黃色葡萄球菌發揮致病作用主要得益于其眾多的毒力因子如α溶血素、腸毒素、殺白細胞素D等。乙?；D移酶(O-acetyltransferase，OatA)作為一種重要的毒力因子，在病原感染中發揮著重要的作用。OatA是一種以不溶性肽聚糖細胞壁聚合物為底物的膜相關蛋白[1]，主要參與宿主的天然免疫。OatA基因缺失金黃色葡萄球菌更易激活宿主的NOD1和NOD2受體，且更易被宿主識別[2]，誘導免疫細胞早期更快分泌炎癥細胞因子和趨化因子[3]。除此之外，OatA可以保護金黃色葡萄球菌免受溶菌酶的溶解作用，OatA基因缺失金黃色葡萄球菌喪失了抗溶菌酶活性，巨噬細胞更易對其清除，但其清除方式尚不明確[4]。

2004年，BRINKMANN等[5]發現了中性粒細胞不同于吞噬和降解來抵抗病原感染的新方式，并將這種新的抵抗病原的方式命名為中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)。NETs是主要以DNA為骨架，其上附著有髓過氧化物酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、組蛋白H3等物質和明膠酶、乳鐵蛋白等特定二、三級顆粒蛋白的網狀結構。NETs可由多種物質刺激產生，包括PMA、A23187、LPS和細菌、真菌、病毒、寄生蟲等。不同刺激物刺激中性粒細胞產生NETs的方式不同，對于病原微生物而言，病原的大小影響NETs的釋放[6]。目前，胞外誘捕網(ETs)的形成已被證明不止存在于中性粒細胞，巨噬細胞、嗜酸粒細胞、肥大細胞和單核細胞等免疫細胞也發現了此種現象[7]。不同的是已有研究證明嗜酸粒細胞釋放的ETs中不含有胞漿蛋白[7]。研究發現，ETs的存在不僅局限于人類，除了小鼠、馬、牛、犬、貓等哺乳動物之外，在魚類和鳥類中也發現了ETs的形成[8-9]。金黃色葡萄球菌可以誘導中性粒細胞產生ETs，其毒力因子表面蛋白A(SpA)基因缺失的金黃色葡萄球菌誘導NETs的能力明顯減弱[10]。然而，毒力因子OatA在ETs形成中發揮的作用尚不明確。因此，本研究通過對比金黃色葡萄球菌OatA基因缺失株ΔOatA-USA300與野生型USA300在METs形成中的差異并初步探討其機制，為進一步解析OatA生物學作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株金黃色葡萄球菌USA300菌株由吉林大學動物醫學學院韓文瑜教授惠贈;USA300 OatA基因缺失菌株由本實驗室構建。

1.2 試驗動物C57BL/6J小鼠購自北京華阜康生物技術股份有限公司，本試驗所有小鼠均為雌性，6～8 周齡，體質量為18～22 g。

1.3 主要試劑SYTOX Green購自Invitrogen公司；LDH檢測試劑盒購自Promega公司；CitH3(R2+R8+R17)抗體購自Abcam公司；羊抗鼠IgG-HRP和羊抗兔IgG-HRP購自Santa Cruz公司；p-ERK、p-P38、p-JNK、GAPDH抗體和羊抗兔IgG(H+L)熒光二抗購自武漢三鷹公司；RPMI-1640購自GIBCO公司；胎牛血清購自Gemini公司；甲醇、氯化鈉等化學試劑購自北京化工廠。

1.4 小鼠骨髓來源巨噬細胞的分離取8周齡的雌性小鼠，在無菌條件下分離小鼠脛骨和腓骨，使用含有0.1%雙抗的RPMI-1640培養基沖取骨髓，骨髓懸液1 000 r/min，4℃離心10 min。使用MGM培養基(65% PRMI. 1640+25% LCCM+10% FBS+0.1%雙抗)重懸并培養，第4 天換新的MGM培養基，第6 天用1%胰酶消化并計數、接種于細胞培養板中。

1.5 LDH檢測將BMDM接種于96孔板中，細胞數為0.2×106個/孔。MOI=20的USA300分別刺激1，2，3，4，5，6 h后吸取細胞培養上清，除試驗組外另收取未感染組及陽性對照組細胞培養上清,使用LDH檢測試劑盒進行檢測。

1.6 胞外DNA定量將BMDM接種于96孔板中，細胞數為0.2×106個/孔。用MOI=20的USA300、ΔOatA-USA300分別刺激1，2，3，4，5 h，收取細胞培養上清，使用SYTOX Green染色后，熒光酶標儀檢測熒光強度(激發波長488 nm,發射波長523 nm)。

1.7 免疫熒光將多聚賴氨酸包被的細胞爬片預先放于24孔板中，細胞數為0.5×106個/孔，用MOI=20的USA300、ΔOatA-USA300刺激3 h。棄掉培養上清，4%多聚甲醛固定20 min；0.1% Trion-X100打孔20 min；5%山羊血清封閉1 h；抗體CitH3 (1∶200)孵育過夜；FITC 羊抗兔二抗(1∶200)孵育1 h；1 μmol/L SYTOX Green染色10 min；防淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.8 Western blot 檢測將BMDM接種于6孔板中，細胞數為3×106個/孔，用MOI=20的USA300、ΔOatA-USA300刺激3 h，收取全細胞裂解液，使用BCA法檢測蛋白含量；甲醇氯仿法提取蛋白，每孔上樣30 μg，SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離；濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫低速振蕩封閉2 h；分別與抗體CitH3(1∶1 000)，p-ERK(1∶1 000)，p-JNK(1∶1 000)，p-P38(1∶1 000)，GAPDH(1∶5 000)孵育過夜；TBST溶液洗滌4次，每次15 min；與羊抗兔IgG-HRP抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h；TBST溶液洗滌4次，每次15 min；顯影后應用Image J進行灰度分析。

1.9 統計學分析試驗數據使用Graphpad Prism 7.0軟件進行分析，統計結果以平均數±標準差表示，組內數據使用單因素方差分析。

2 結果

2.1 OatA 抑制骨髓來源巨噬細胞(BMDM)胞外DNA的釋放為了檢測OatA對BMDM胞外DNA的釋放是否有影響，通過熒光酶標儀定量檢測胞外DNA釋放量，結果表明ΔOatA-USA300感染后1，2 h胞外DNA釋放量與USA300組沒有明顯差異；3，4，5 h 胞外DNA釋放量顯著多于USA300組(圖1)。在感染1～5 h的LDH生成量與空白對照相比均沒有明顯差異(圖2)。由此得出OatA可抑制骨髓來源巨噬細胞胞外DNA 的釋放。

圖1 毒力因子OatA對巨噬細胞胞外DNA釋放的影響 圖2 LDH生成量檢測

2.2 OatA 抑制METs的形成為了進一步探討OatA 對METs形成的影響，使用Western blot方法檢測CitH3的表達，結果表明ΔOatA-USA300感染組CitH3表達量顯著多于USA300感染組(圖3A),免疫熒光顯示ΔOatA-USA300感染組胞外DNA與CitH3共定位顯著多于USA300感染組(圖3B)。由此得出，OatA可抑制METs的形成。

A.Western blot檢測CitH3；B.免疫熒光結果(綠色為DNA，紅色為CitH3，黃色為DNA與CitH3共定位)

2.3 OatA 抑制MAPK通路的激活為了進一步探討毒力因子OatA對于METs形成的機制，通過Western bolt方法檢測MAPK信號通路中關鍵蛋白(JNK、ERK、p38)的激活。結果顯示，ΔOatA-USA300感染組的JNK、ERK、p38磷酸化水平顯著多于USA300感染組(圖4)。由此可以得出，OatA 通過抑制MAPK通路的激活來抑制METs的形成。

A.Western blot檢測p-JNK、p-ERK和p-P38的表達；B.A圖的灰度掃描

3 討論

當病原微生物侵入機體，機體會迅速啟動免疫反應來抵御病原微生物。ETs作為一種新發現的抵御病原感染的方式，在細菌、真菌、寄生蟲和病毒感染中起著非常重要的作用。ETs依靠其網狀結構可以捕獲細菌，現已有研究證明，ETs可以捕捉金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等[11-12]。為了防止在試驗過程中金黃色葡萄球菌過量感染導致大量的細胞死亡從而影響試驗結果的準確性，首先檢測了金黃色葡萄球菌感染BMDM不同時間的LDH生成量，確定了感染時間應為5 h以內。通過檢測不同時間胞外DNA量，發現缺失毒力因子OatA的金黃色葡萄球菌可以導致巨噬細胞釋放更多的胞外DNA。ETs上附著有NE、MPO、組織蛋白酶G、組蛋白H3、CitH3等物質，ETs的形成過程伴隨著組蛋白H3的瓜氨酸化[13]。本試驗發現金黃色葡萄球菌在缺失毒力因子OatA時可導致巨噬細胞表達的CitH3增加。由此可以推斷，金黃色葡萄球菌毒力因子OatA可抑制METs的形成。

自ETs被發現以來，眾多的研究者對其進行了研究，但是其形成機制眾說紛紜。現有的研究認為NETs形成大體上依賴于2條途徑：NADPH氧化酶(NOX)依賴型和NADPH氧化酶非依賴型。以PMA為代表的NETs經典激動劑主要依賴于NOX生成ROS促進染色質解聚。以A23187為代表的激動劑誘導 NETs 形成時，其ROS來源于線粒體[14]，屬于NOX 非依賴型。ROS是在ETs形成過程中的一個關鍵產物，慢性肉芽腫患者體內NOX酶存在缺陷，因此無法產生NETs。NETs釋放主要被視為由外部刺激激活的細胞內在途徑驅動的活躍過程。在NOX非依賴型，有研究者發現NE和MPO是NETs形成過程中后期所必須的[15]。但現在已經被推翻，認為NE和MPO 只是在某些特定的NETs形成過程中起作用[16]。蛋白質精氨酸脫亞氨酶4(PAD4)在中性粒細胞中含量豐富，鈣離子和PAD4 復合物進入細胞核，可以促進組蛋白瓜氨酸化加速染色質的解聚。在抑制PAD4或缺乏PAD4小鼠中NETs的形成能力受損[17]。中性粒細胞體外使用二甲雙胍預處理后，PMA刺激NETs的形成明顯減少，雖然具體的機制還不清楚但這反映了NETs的形成可能與糖代謝有著密切的關系。此外MAPK(ERK、JNK、p38)介導的轉錄活化也分別參與NOX依賴型和非依賴型。HAKKIM等[18]首次證明MAPK 通路促進NETs的形成，隨后在LPS和豬鏈球菌2型等誘導的NETs形成中均再次證明[19-20]。本研究發現毒力因子OatA缺失后MAPK通路中關鍵蛋白ERK、p38、JNK磷酸化水平顯著提高，表明了金黃色葡萄球菌毒力因子OatA一定程度上抑制MAPK通路的激活以抑制METs的形成。

綜上所述，本研究以毒力因子OatA對METs的影響為主線，發現OatA基因缺失后促進METs形成且更強烈地激活MAPK通路，得出OatA通過抑制MAPK通路的激活以抑制METs的形成。這進一步豐富了金黃色葡萄球菌宿主感染中毒力因子所發揮的作用，為更深入研究毒力因子OatA在病原菌感染和抵抗宿主防御方面奠定基礎。