巨噬細胞鳥苷酸結合蛋白5在新孢子蟲感染中的作用

陳夢閣，李 新，張 旭，王曉岑，張西臣，宮鵬濤，李建華

(吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

新孢子蟲是近年來發現的一種在細胞內寄生的頂復門原蟲，主要是犬新孢子蟲(Neosporacaninum)。其終末宿主為犬、狼等犬科動物，中間宿主為牛、羊、鹿等多種動物，其中對牛的危害最為嚴重，是造成奶牛流產的主要原因之一，給養殖業造成嚴重的經濟損失[1]。新孢子蟲病呈世界性分布，包括中國在內的30多個國家和地區都有報道，我國山東、河北、內蒙古等3地奶牛的血清抗體陽性率分別為17.0%，37.0%，3.3%[2]。近年來對新孢子蟲病流行病學、侵入機制等的研究很多，但依舊尚未有防治新孢子蟲病的特效藥及疫苗。先天免疫和獲得性免疫在清除新孢子感染中發揮重要作用，對抗新孢子蟲免疫機制的研究將為該病防控提供理論依據。

鳥苷酸結合蛋白(guanylate-binding protein，GBP)是一個高度保守的IFN誘導的GTPase家族，它們最初在干擾素處理的人和小鼠細胞系中被鑒定為67 kDa蛋白[3]。GBPs家族由7個人類GBPs、11個小鼠mGBPs和2個編碼mGBPs的小鼠假基因組成[4]，是細胞自主免疫的重要組成部分，作為對IFN信號的響應，GBPs在免疫細胞和非免疫細胞的細胞質中表達，并能迅速組裝成大型防御復合體，靶向細胞內細菌、病毒和寄生蟲，或釋放殺傷性成分，對抗各種病原[5]。研究發現，GBPs蛋白家族在IFN-γ刺激、單核增生李斯特菌以及弓形蟲感染后高表達[6]，可以控制小鼠體內牛分枝桿菌[7]、嗜肺軍團菌[8]和弓形蟲[9]等病原感染。作為GBPs家族的成員，GBP1影響沙眼衣原體在巨噬細胞內的復制[10]、控制弓形蟲的細胞內增殖[9]、并可抑制水泡性口炎病毒和心肌炎病毒的復制[11]。GBP2和GBP5抑制寨卡病毒、甲型流感和艾滋病病毒增殖[12]。GBP3抑制流感病毒的細胞內復制[13]。此外，GBP1在沙門菌感染期間促進焦亡，在弓形蟲感染期間促進凋亡[14]；GBP5在響應細菌感染時促進NLRP3炎癥小體激活[15]。在新孢子蟲感染過程中IFN-γ能夠有效控制其復制和介導宿主反應[16]，但是新孢子蟲感染對GBPs表達的影響，以及GBPs在新孢子蟲感染中的作用目前尚未見報道。

本研究首先篩選出新孢子蟲感染小鼠巨噬細胞后上調表達的mGBP5基因，然后過表達mGBP5來探究其對新孢子蟲生長的影響，為以GBP5為靶標開展新孢子蟲病防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 蟲體、細胞和實驗動物新孢子蟲速殖子Nc-1株、Vero和293T細胞均由本實驗室凍存。6～8周齡野生型C57BL/6雌鼠購自遼寧長生實驗動物中心。

1.2 主要試劑RPIM-1640培養基購自Life Technologies公司；胎牛血清FBS購自BI公司；Percoll購自GE Healthcare公司；20×PBS購自上海生工；巰基乙酸培養基購自BD公司；TRIzol購自Life Technologies公司；反轉錄試劑盒、T4連接酶均購自TaKaRa公司；FastStart Universal SYBR Master購自Roche公司；RIPA細胞裂解液購自碧云天公司；兔抗GBP5、羊抗兔IgG-HRP、羊抗兔IgG(H+L)熒光抗體均購自Proteintech公司；PCR產物回收試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；質粒小提試劑盒及無內毒素質粒提取試劑盒購自天根生化生物有限公司。

1.3 新孢子蟲速殖子的培養將新孢子蟲速殖子接種于Vero細胞中進行培養，所用培養基為含有2% FBS和1%雙抗的RPIM-1640培養基，在37℃、5% CO2細胞培養箱中進行培養，每天更換培養基，待速殖子從細胞中完全溢出后，吸出1 mL進行傳代培養，其余蟲體用Percoll法純化待用。

1.4 小鼠腹腔巨噬細胞的分離及培養用3 mL巰基乙酸培養基對小鼠進行腹腔注射，3～4 d后安樂處死小鼠，將其置于75%酒精中浸泡10 min，隨后在無菌條件下進行腹腔巨噬細胞的分離。用10 mL注射器將適量1×PBS注入小鼠腹腔內，隨后吸出放于50 mL離心管，400 r/min離心10 min，用1 mL 培養基重懸巨噬細胞，計數后鋪于細胞培養板，用添加10% FBS和1%雙抗的RPIM-1640培養基于37℃、5% CO2培養箱中培養。

1.5 熒光定量PCR檢測mGBPs mRNA的表達將小鼠巨噬細胞以3×106個/孔的密度鋪于6孔細胞培養板培養6 h，待其貼壁，用感染復數(MOI)分別為1，3，5的新孢子蟲感染細胞12 h。用感染復數為3的新孢子蟲刺激細胞不同時間(6，12，24 h)收集細胞。用TRIzol法裂解細胞后，提取細胞的總RNA；將各組細胞的2 μg 總RNA利用反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA。根據GenBank已公布序列，設計小鼠mGBP1-mGBP11和內參GAPDH熒光定量PCR的引物(表1)，按照熒光定量PCR反應體系：10 μL SYBR Green Master(2×)、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、8 μL 5倍稀釋后的cDNA，將上述幾種成分避光加入到八連管中，每個樣品需重復3次。反應條件為95℃，3 min→95℃，30 s；55℃，30 s；72℃，30 s(45個循環)→72℃，10 min。

表1 小鼠GBP1-GBP11 熒光定量PCR引物

1.6 Western blot檢測mGBP5表達將小鼠巨噬細胞以3×106個/孔的密度鋪于6孔細胞培養板，培養6 h使其貼壁，用感染復數為1，3，5的新孢子蟲刺激細胞12 h，收取全細胞裂解液，使用BCA法檢測蛋白含量；每孔上樣30 μg，SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；4℃過夜孵育兔抗mGBP5(1∶2 000)和GAPDH(1∶1 000),TBST洗膜4次，10 min/次；結合羊抗兔IgG-HRP抗體(1∶5 000)室溫孵育1 h,TBST洗膜4次，10 min/次；膜通過增強化學發光液(ECL)和Western blot檢測系統進行蛋白檢測，應用Image J進行灰度分析。

1.7 免疫熒光檢測mGBP5定位將小鼠巨噬細胞以5×105個/孔的密度鋪于24孔細胞培養板內的玻片上，待其貼壁，用新孢子蟲刺激12 h，去除細胞培養上清，用1×PBS洗細胞3次；用4%的組織固定液于室溫下對細胞固定20 min，洗細胞3次；隨后用0.5% 的TritonX-100透化細胞20 min，洗細胞3次；之后用3%的BSA對細胞室溫封閉1 h；mGBP5抗體4℃孵育過夜，用PBST洗細胞3次；再用熒光二抗對細胞進行室溫避光孵育1 h，PBST洗細胞3次；用DAPI對細胞核進行染色20 min，PBST洗細胞3次；將細胞爬片晾干，用防熒光淬滅劑封片，通過激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.8 pcDNA3.1-mGBP5真核表達質粒的構建及轉染根據mGBP5基因序列(NM_153564.2)和真核表達載體pcDNA3.1的多克隆位點設計引物，GBP5F:5′-GGGTACCGCCACCATGGCCCCAGA-GATTCACATGC-3′；GBP5R:5′-CCTCGAGGCTTATAACACAGTCATGATGATGT-3′，引物由庫美生物科技有限公司合成。以小鼠腹腔巨噬細胞的cDNA為模板，PCR擴增GBP5基因。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用PCR產物回收試劑盒對所擴增的GBP5基因進行純化。將mGBP5基因的純化產物和pcDNA3.1質粒用KpnⅠ和XhoⅠ快切酶進行37℃酶切20 min，酶切產物經純化回收后利用T4連接酶于4℃過夜連接；連接產物轉化進入BL21感受態中，37℃搖床培養1 h后涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養基上，37℃倒置培養；挑取單菌落進行PCR驗證，對陽性菌液擴大培養后提取質粒DNA，進行雙酶切鑒定并送庫美生物科技有限公司進行測序。分別將pcDNA3.1-mGBP5真核表達載體、空載體pcDNA3.1轉染293T細胞24 h，Western blot檢測mGBP5表達。

1.9 熒光定量PCR檢測新孢子蟲的數量將質量為1，3 μg的pcDNA3.1-mGBP5真核表達載體和空載體pcDNA3.1的無內毒素質粒分別轉染293T細胞24 h后，用一定量的新孢子蟲(MOI=0.5)感染上述各組細胞12 h后，收取細胞并提取細胞基因組，進行DNA濃度測定。根據新孢子蟲(X84238)基因序列設計熒光定量PCR引物，上游引物：5′-ACTGGAGGCACGCTGAACAC-3′；下游引物：5′-AACAATGCTTCGCAAGAGGAA-3′，引物由庫美生物科技有限公司合成。將1×108新孢子蟲速殖子的基因組 DNA稀釋成1×107,1×106,1×105,1×104,1×103新孢子蟲所對應的質量200 ng，用于制作標準曲線。以試驗組細胞的 200 ng 基因組 DNA 為模板，按照熒光定量PCR反應體系：10 μL SYBR Green Master(2×)、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、200 ng DNA、補足ddH2O(總體積20 μL)。將上述幾種成分避光加入到八連管中，每個樣品需重復3～4次。反應條件為95℃，5 min→ 95℃ 30 s,60℃ 30 s(30個循環)。對數據進行分析處理，根據標準品Ct值及對應的蟲體數量制作標準曲線，得出試驗組對應的蟲體數量。

2 結果

2.1 新孢子蟲感染促進小鼠巨噬細胞中GBP1-GBP11 mRNA的表達新孢子蟲感染小鼠巨噬細胞后，用熒光定量PCR檢測mGBPs mRNA表達。結果表明，與未感染組相比，感染復數(MOI)為1，3，5時小鼠巨噬細胞中mGBP1-mGBP11 mRNA表達均升高(圖1A)。感染復數為3的蟲體感染6，12，24 h 后mGBP1-mGBP11 mRNA的表達量均明顯升高(圖1B)，其中mGBP5 mRNA表達極顯著性升高(P<0.001)。

A.不同數量新孢子蟲感染巨噬細胞中mGBPs mRNA表達；B.新孢子蟲感染不同時間巨噬細胞中mGBPs mRNA表達。* P<0.05；** P<0.01；*** P<0.001。下同

2.2 新孢子蟲感染引起小鼠巨噬細胞中GBP5蛋白表達量升高用Western blot 檢測新孢子蟲感染引起小鼠巨噬細胞中GBP5的蛋白表達水平，并做灰度分析。結果表明，與未感染組相比，新孢子蟲感染組的mGBP5蛋白的表達量極顯著性升高，且與蟲體感染數量呈正比(P<0.001)(圖2)。

A.GBP5蛋白的過表達；B.灰度分析

2.3 新孢子蟲感染小鼠巨噬細胞中GBP5聚集在納蟲泡膜間接免疫熒光染色后通過激光共聚焦顯微鏡觀察mGBP5在新孢子蟲感染小鼠巨噬細胞中的定位。結果表明，新孢子蟲感染細胞中mGBP5蛋白聚集在新孢子蟲的納蟲泡膜上，而未感染組mGBP5蛋白散布在細胞質中(圖3)。

圖3 間接免疫熒光觀察GBP5定位(放大倍數為60倍，紅色箭頭指向納蟲泡)

2.4 pcDNA3.1-mGBP5真核表達載體的構建及驗證瓊脂糖凝膠電泳結果顯示mGBP5基因擴增產物大小約為1 773 bp，與預期目的基因片段大小相一致(圖4A)。重組質粒的雙酶切鑒定結果表明，酶切產物大小與基因預期大小相符合(圖4B)。進一步測序結果表明成功構建了pcDNA3.1-mGBP5真核表達載體。通過Western blot 檢測確定pcDNA3.1-mGBP5真核表達質粒在293T細胞內成功表達，mGBP5蛋白表達量隨質粒轉染質量的增加而升高(圖4C)。

A.PCR產物電泳圖(M1.DL2000 DNA Marker;1.mGBP5 PCR產物)；B.表達質粒雙酶切電泳圖(M2.DL10000 DNA Marker;1.pcDNA3.1-mGBP5雙酶切產物)；C.mGBP5蛋白過表達水平

2.5 mGBP5抑制新孢子蟲的增殖新孢子蟲感染分別轉染pcDNA3.1-mGBP5和pcDNA3.1的293T細胞，熒光定量檢測新孢子蟲的數量。結果表明，與空載體組相比，mGBP5過表達組的新孢子蟲數量明顯減少，空載體組的蟲體數量是轉染GBP5(1 μg)組蟲體數量的1.9倍、轉染GBP5(3 μg)組蟲體數量的2.8倍，且轉染GBP5(3 μg)組蟲體數量小于轉染GBP5(1 μg)組(P<0.05，P<0.01)(圖5)。以上結果顯示，mGBP5蛋白起到抑制新孢子蟲增殖的作用。

圖5 熒光定量PCR檢測新孢子蟲數量

3 討論

最近的研究表明，病毒、細菌和寄生蟲等多種病原體感染都能夠引起GBPs的表達上調，且GBPs與細胞膜之間的相互作用是抗病原體的機制之一。在病毒方面，已報道甲型流感病毒通過激活NF-кB途徑上調GBP5的表達[17]。此外，在IFNγ刺激BMDMs中，GBP1、GBP2和相關成員IRGA6被發現定位于諾如病毒膜上[18]。在細菌方面，弗朗西斯桿菌感染小鼠骨髓源巨噬細胞上調GBP2和GBP5的表達，且共聚焦顯微鏡觀察顯示，GBP2和GBP5都定位于弗朗西斯桿菌的表面，使菌體質膜破裂，導致細菌的死亡[19]。在寄生蟲方面，弓形蟲弱毒株ME49和強毒株BK感染星形膠質細胞后，mGBP1、mGBP2、mGBP3、mGBP6、mGBP7和mGBP9能夠聚集在弓形蟲ME49株的納蟲泡膜上；而強毒株BK則能夠避免mGBPs在其納蟲泡膜上的積累[6]。mGBP1在弓形蟲感染的間充質基質細胞中高表達，且定位于弓形蟲納蟲泡膜[20]。而mGBP2不僅被招募到弓形蟲的納蟲泡膜上，而且能夠進入納蟲泡腔，并直接聚集在寄生蟲的質膜上，破壞了寄生蟲的完整性[21]。本研究發現新孢子蟲感染能夠誘導小鼠巨噬細胞GBP1-GBP11共11種mGBP的mRNA表達水平升高，其中mGBP5蛋白呈高表達且聚集在新孢子蟲的納蟲泡膜上。本研究還發現其他10種GBP mRNA表達也上調，它們在新孢子蟲感染細胞中的定位有待下一步研究。

已報道GBPs能夠抑制病毒、細菌和寄生蟲等多種病原體的復制。在病毒方面，在感染腦心肌炎病毒的HeLa細胞和小鼠成纖維細胞中，mGBP2已經被證明介導抗病毒活性[22]。在細菌方面，GBP5促進NLRP3炎癥小體對鼠傷寒沙門菌的抑制作用，Gbp5-/-小鼠在體外發現明顯的Caspase-1和IL-1β切割缺陷，在體內發現NLRP3依賴的炎癥反應和宿主防御受損[15]。在寄生蟲方面，之前的研究表明mGBP1、mGBP2、mGBP3、mGBP6、mGBP7和mGBP9在IFN-γ激活的小鼠胚胎成纖維細胞中被招募到含有弓形蟲的納蟲泡膜中，抑制弓形蟲的增殖[6]。本研究通過分析發現小鼠與人源GBP5同源性達97%，并成功構建了過表達mGBP5的293T細胞模型，發現293T細胞中過表達mGBP5組與空載體組相比，新孢子蟲數量顯著減少，且與過表達mGBP5的量呈反比，表明mGBP5可抑制新孢子蟲的增殖。進一步通過基因敲除等技術研究GBP5抗新孢子蟲感染的作用及機制將促進我們對抗新孢子蟲感染免疫應答的深入理解。

綜上，本研究發現新孢子蟲感染能夠誘導mGBP1-mGBP11 mRNA的表達量上調，其中mGBP5蛋白表達量極顯著升高。進一步以mGBP5在新孢子蟲感染中的作用為主線，成功構建了pcDNA3.1-mGBP5真核表達載體及過表達mGBP5的293T細胞模型，并且發現mGBP5能夠靶向新孢子蟲的納蟲泡膜起到抑制新孢子蟲增殖的作用。本研究為后續深入研究mGBP5的功能奠定基礎，但仍需進一步研究GBPs與新孢子蟲感染之間的關系，如mGBP5是否介導NLRP3炎癥小體的激活來調控新孢子蟲的增殖以及其他10種GBP在新孢子蟲感染中的作用，這將為新孢子蟲病的防治提供新思路。