基于牛源A型多殺性巴氏桿菌溶血表型的蛋白組學分析

王佳楠，汪德會，李 攀，王遠蘭，趙宗鈴，彭遠義

(西南大學 動物科技學院，重慶400700)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida,Pm)是一種革蘭陰性條件致病菌，根據其莢膜抗原的不同可分為A、B、D、E和F共5種血清型[1]，其中牛源A型多殺性巴氏桿菌作為牛呼吸道正常棲息菌，在應激條件下引起的牛呼吸道疾病綜合征可給養牛業造成巨大的經濟損失[2]。目前多殺性巴氏桿菌的致病機制尚不明確，研究其致病機制可對多殺性巴氏桿菌病的防控提供理論依據。

細菌溶血素是細菌分泌的一類外毒素。目前，已知細菌、對蝦[3]、微藻[4]、植物病原體[5]、螺旋體[6]、支原體[7]等生物皆能分泌溶血毒素。可分為重復子毒素家族(repeats in toxin family，RTX)、膽固醇依賴細胞溶素家族(cholesterol-dependent cytolysin family，CDC)以及其他類。重復子毒素家族蛋白的概念在1991年首次被提出，該家族蛋白的羧基(C)端有一段富含甘氨酸-天冬氨酸的九肽重復序列(G-G-XG-(N/D)-D-x-(L/I/F)-X)，該區域內含Ca2+結合位點；在氨基(N)末端區域具有疏水結構域，該結構域可參與靶膜孔的形成；該家族蛋白通過Ⅰ型分泌系統轉運至胞外后結合Ca2+而激活，并與宿主細胞膜相互作用[8]。膽固醇依賴型細胞溶素(cholesterol dependent cytolysins，CDCs)是一種成孔毒素(pore-forming toxins，PFTs)，后發現革蘭陰性菌也能分泌此類毒素[9]。大多數CDC家族成員之間具有較高的相似性，其基本特征是該毒素結構域4(domain 4)的L1環(Loop 1)含有一段保守的膽固醇識別基序(cholesterol recognition motif，CRM)ECTGLAWEWWR，可與靶膜上的膽固醇受體發生結合，從而產生一系列的生物學效應[10]。其他類中像磷脂酶具有磷酸二酯酶(如PLC和PLD)和酰基水解酶(如PLA1，PLA2，PLB)的活性[11]。目前，與溶血功能相關且研究得較多的有磷脂酶A1，A2和C。例如，嗜肺桿菌plaB是編碼主要細胞相關磷脂酶A的基因，可能由于其溶血活性而導致細菌細胞毒性[12]。

作為重要的毒力因子，溶血素可通過損傷細胞組織、誘導細胞凋亡、激活補體和促進炎癥反應等參與細菌的致病作用。多殺性巴氏桿菌的溶血性可為我們探究其致病機制提供新的思考方向，即其是否也分泌溶血素樣蛋白進而導致炎癥反應，殺傷組織細胞。如α-溶血素在宿主細胞膜上形成孔洞后可通過NLRP3炎性小體激活caspase-1,進而切割IL-1β前體轉化為成熟的IL-1β,并導致細胞焦亡的發生[13-14]。我們實驗室前期發現，多殺性巴氏桿菌感染可誘導NLRP3炎癥小體激活，進而導致caspase-1的激活和IL-1β的分泌[15]。厭氧條件下出現的溶血現象讓我們猜測多殺性巴氏桿菌是否也產生溶血素樣蛋白發揮類似作用，誘導NLRP3炎癥小體激活進而導致炎性因子分泌。另一方面，α-溶血素分泌系統是目前研究最透徹的革蘭陰性菌Ⅰ型分泌系統，由HlyB，HlyD，TolC 3個蛋白組成。我們在PmCQ2的蛋白組中發現了TolB，TolC的存在，如果引起溶血的也是HlyD家族蛋白，那么對于確定多殺性巴氏桿菌的分泌系統便具有指導價值，同時在理論上可以使用此分泌系統構建分泌型活載體疫苗，為巴氏桿菌病的防控提供新思路。

蛋白組學的應用非常廣泛，在微生物方面，可用于研究細菌的耐藥機制、致病機制、本身的生理特性機理以及新型疫苗的研發等[16]。例如，RAY等[17]用label free蛋白組學技術鑒定了水解蛋白弧菌(Vibrioproteolyticus)中的一個溶血素基因(VPRH)，并闡明該基因可使HeLa細胞肌動蛋白重排且具有毒性作用，是一個重要的毒力因子。本研究旨在用蛋白組學技術并結合生物信息學分析，以期篩選到多殺性巴氏桿菌可能的溶血因子，為其溶血機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株及動物牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ1～PmCQ7，PmB ，PmF和禽源PmQ分離并暫存于本實驗室,根據形態特征、生化特性、16SrRNA基因序列分析以及對物種特異性基因Kmt-1進行PCR擴增確定以上所用菌株為多殺性巴氏桿菌，進一步通過PCR擴增血清特異性基因hyaD-hyaC，bcbD，dcbF，ecbJ和fcbD確定所用菌株的莢膜血清型[18]；大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態細胞購于重慶拓世眾和生物公司；pET-32a(+)和pET-30a保存于本實驗室。

4～5周齡雌性昆明小鼠(18～22 g)、成年新西蘭大白兔購自重慶恩斯維爾生物科技有限公司。

1.2 主要試劑馬丁肉湯、LB肉湯、BHI肉湯均購于海博生物公司。IPTG、卡那霉素、氨芐西林鈉、50倍TAE電泳緩沖液、丙烯酰胺/甲叉29∶1,30%溶液、1.5 mol/L Tris-HCl溶液(pH8.8)、1 mol/L Tris-HCl溶液(pH6.8)、10% SDS溶液均購自上海生工有限公司；甘氨酸、tris、脫脂奶粉購于BIOFROX公司；細菌mRNA提取試劑盒購自于天漠生物公司；一步法反轉錄試劑盒購于天根公司；ECL顯色液和BCA試劑盒購于碧云天公司。

1.3 引物設計引物序列來源于牛源A型多殺性巴氏桿菌PmCQ2(CP033599)基因組，引物合成自上海生工生物公司(表1)。

表1 引物序列

1.4 PmCQ2的溶血活性分析從-80℃冰箱取出PmCQ2種子液，劃線接種于馬丁固體血培養基上，37℃恒溫培養18 h，挑取單菌落接種于馬丁試管液體培養基中，37℃，220 r/min恒溫搖床培養10 h左右至對數期，即得到可使用的活化菌株。將活化的菌液分別劃線接種于馬丁、LB和BHI兔血平板，每種肉湯固態培養基進行3個生物學重復，操作重復2次，然后將其分別放置于有氧和厭氧恒溫(37℃)培養箱中，分別培養觀察3～5 d，觀察溶血情況。

PmCQ2先有氧培養再厭氧培養，大致步驟同上，將PmCQ2分別劃線于馬丁兔血平板和LB兔血平板，先放置于有氧條件的恒溫培養箱中，培養12 h后，觀察并記錄溶血情況；然后將PmCQ2生長良好的平板轉移至厭氧培養箱中，繼續培養72～96 h，觀察并記錄此時的溶血情況。

1.5 其他血清型Pm的溶血活性分析將PmCQ1～PmCQ7，PmB ，PmF和PmQ菌株按照1.4步驟，觀察并記錄溶血情況。

1.6 制備蛋白樣品及送樣按照1.4方法活化多殺性巴氏桿菌PmCQ2，將對數期的菌液原菌涂布接種于12個馬丁兔血平板(并以劃線培養作為溶血現象的觀察)，將平板分別放置于有氧恒溫(37℃)培養箱及厭氧恒溫培養箱，有氧培養12 h，厭氧培養65 h，用無菌細胞刮收集菌體于無菌凍存管，速凍液氮后于-80℃保存備用，有氧組(對照組)及厭氧組(試驗組)各設置3個生物學重復，各組別分別命名為X2，X3和X4以及Y1，Y2和Y3。將樣品用干冰運輸至杭州景杰生物公司。

1.7 qRT-PCR轉錄水平驗證熒光定量PCR驗證蛋白組數據的轉錄水平，按照mRNA提取試劑盒說明書提取細菌樣品RNA，酶標儀測濃度后按照天根公司FastKing反轉錄試劑盒進行反轉錄得到cDNA，以5 μL SYBR熒光定量酶，上下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，dd H2O 3 μL進行qRT-PCR。

1.8 Western blot蛋白水平驗證用大腸桿菌BL21(DE3)菌株誘導表達所驗證蛋白，將純化的蛋白與佐劑按4∶1混合，皮下多點免疫小鼠，二免后對小鼠斷尾采血，收集血清即為一抗。取送樣時的全菌蛋白裂解液上清，蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳，轉膜，用添加0.05%脫脂奶粉的TBST混合液37℃封閉，洗滌液清洗5次后加一抗于4℃過夜孵育，再次洗滌后進行二抗孵育1 h，最后取等量ECL顯色液A/B混勻，用蛋白成像儀顯色成像。

1.9 假定溶血因子的分析及篩選根據蛋白組學結果和溶血素本身的性質特點，主要從蛋白差異表達倍數及注釋、蛋白的亞細胞定位、蛋白結構域及其家族主要功能幾個方面進行篩選。

2 結果

2.1 PmCQ2在有氧及厭氧條件下的溶血情況結果顯示有氧條件下PmCQ2在馬丁兔血平板上沒有溶血活性，而厭氧條件下其在馬丁、BHI及LB兔血平板上均有明顯的溶血活性。接種于馬丁、LB兔血平板的PmCQ2，先有氧培養12 h，不具有溶血活性，而轉移至厭氧條件再培養72～96 h時可出現溶血活性(圖1)。

A.PmCQ2在有氧和厭氧條件下,于馬丁、BHI及LB兔血平板分別培養;1.馬丁有氧條件;2.馬丁無氧條件;3.BHI厭氧條件;4.LB厭氧條件;B.PmCQ2于馬丁、LB兔血平板，先有氧培養后厭氧培養;5.LB有氧條件;6.LB平板轉移至厭氧條件;7.馬丁有氧條件;8.馬丁平板轉移至厭氧條件

2.2 不同血清型多殺性巴氏桿菌的溶血情況經多次試驗重復驗證，厭氧培養條件下，牛源A型PmCQ1 ～ PmCQ7，B型PmB ，F型PmF和禽源PmQ分別在LB，馬丁及BHI兔血平板上均具有溶血活性(表2)。

表2 不同血清型多殺性巴氏桿菌的溶血情況

2.3 蛋白提取及濃度測定細菌蛋白濃度測定用BCA法進行，濃度如表所示,達到檢測標準(表3)。

表3 蛋白樣品質量濃度

2.4 差異表達蛋白定量結果多殺性巴氏桿菌在厭氧條件具有溶血表型，其厭氧條件(PMCQ2_Y)下較有氧條件(PMCQ2_X)而言，蛋白發生了顯著的變化，以ratio>1.2倍(或ratio<0.83)為差異表達變化閾值，以統計學t檢驗P<0.05為顯著性閾值，PMCQ2_Y/ PMCQ2_X比較組中有164個蛋白表達上調，282個蛋白表達下調(圖2)

圖2 不同比較組中差異表達蛋白數量分布柱形圖

2.5 亞細胞定位分類所有的差異蛋白亞細胞定位顯示(圖3)，有270，95，47，24和10個蛋白亞細胞分別定位于細胞質、細胞周質、內膜、外膜和胞外，同時占所有差異蛋白的比例分別為60.54%，21.3%，10.54%，5.38%和2.24%。

圖3 差異蛋白的亞細胞結構定位分布圖

2.6 差異表達蛋白的富集分析對差異表達蛋白進行GO分類、KEGG通路和蛋白結構域富集分析，為發現差異表達蛋白在某些功能類型上是否存在顯著性的富集趨勢。對富集檢驗P值用氣泡圖方式顯示差異蛋白的顯著富集(P<0.05)。

2.6.1GO功能的富集分析 將P<0.05的GO term的顯著富集差異蛋白進行分類，結果如表4所示，在細胞組分中差異蛋白主要富集在胞質部分、核糖體、內核蛋白復合體、非膜細胞器和細胞內非膜細胞器等條目；在分子功能中主要富集在核糖體的結構組成、過度金屬離子結合和鐵離子跨膜轉運活性等條目；在生物進程中主要富集在肽聚糖的生物合成、鐵離子結合和細胞蛋白復合物組裝等條目。

表4 差異蛋白GO功能顯著富集分布

2.6.2蛋白結構域富集分析 由圖4可見，差異蛋白主要聚集于Single hybrid motif結構域、Biotin/lipoyl attachment結構域、ABC轉運蛋白質結合域、氯霉素乙酰轉移酶結構域、未知功能(DUF21)結構域和轉運相關結構域等。

圖4 差異蛋白蛋白結構域富集分布圖

2.6.3差異蛋白pathway富集分析 如圖5可見，差異蛋白主要富集于核糖體(ribosome)、肽聚糖生物合成(peptidoglycan biosynthesis)、脂肪酸代謝和生物合成(fatty acid metabolism and biosynthesis)通路、丁酸酯代謝(butanoate metabolism)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、檸檬酸循環(TCA循環)(citrate cycle，TCA cycle)和丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)等通路。

圖5 差異蛋白pathway富集分布圖

2.7 qRT-PCR在轉錄水平驗證蛋白組結果選取8個差異蛋白(Pm1264，Pm1081，Pm0040，Pm0634，Pm0441，Pm0057，Pm1427和Pm1384)在轉錄水平進行驗證，X-12和Y-65分別表示有氧條件及厭氧條件的取樣時間點。結果如圖6所示，蛋白的轉錄水平與蛋白的表達趨勢基本一致。

圖6 蛋白組結果轉錄水平驗證

2.8 Western blot在蛋白水平驗證蛋白組結果Pm2109，Pm2214和Pm769蛋白根據預測結果均有溶血素家族蛋白相關結構域，且在厭氧條件下表達均上調，故選取該3個蛋白進行蛋白水平驗證，其ratio(Y/X)值分別為1.262，1.232和1.085，由圖7可見(每孔上樣量為10 μg)，Pm2214及Pm769在厭氧組別中(Y1，Y2，Y3)的表達(灰度值)比有氧組別多，結果與蛋白組測定結果基本一致，而Pm2109的表達差異不明顯。

圖7 蛋白組結果蛋白水平驗證

2.9 假定溶血因子的篩選及分析對于假定溶血因子的篩選一方面是參考在其他細菌已報道的溶血素，從所得蛋白的注釋、基因家族功能以及本身功能作用等方面作篩選；另一方面則是需要去挖掘未知的可能與溶血素相關的蛋白作為候選因子，這部分主要從差異蛋白的差異倍數并結合注釋、亞細胞定位等經綜合分析后作篩選。

2.9.1基于差異表達倍數及亞細胞定位篩選 結果如表5所示，0040是基因ID CQ2GL000040的簡稱， 以及0090，0057均為假定蛋白，沒有功能注釋，在厭氧條件下顯著高表達于有氧條件，雖然0040，0057等亞細胞定位顯示在細胞質和內膜，但有可能對溶血素效應蛋白起調控或者轉運作用，如RTX毒素家族中的RtxB蛋白便是整合到細菌內膜的ABC結合轉運蛋白。0634編碼一種外膜蛋白，對其結構域進行描述時發現其形成β-桶狀結構，關于溶血素的研究發現RTX家族中的rtx毒素蛋白在結合Ca2+后其C末端結構域在T1SS出口處折疊形成β-桶狀結構[18]，以及在CDC家族中由多個單體組裝成的環狀孔道前孔復合物可調整形成β-桶狀結構[19]。1333注釋為溶血素D，與溶血素轉運有關[20]，且定位于外膜，在厭氧組中高表達。

表5 部分極顯著差異表達蛋白的特征

2.9.2基于基因家族主要功能及蛋白結構域的篩選 結果如表6所示，2109，2214和806的蛋白注釋皆為HlyC/CorC 家族轉運子，其蛋白結構域(COD)皆有CBS/Transporter保守結構域，該家族經預測與溶血素的分泌相關，且有相應文獻的報道[21]；而769，0025是HlyD家族蛋白，該家族蛋白與溶血素的轉運相關[22]，1211是SGNH超家族的一類蛋白，注釋為磷脂酶的一部分，故將Pm2109，Pm2214，Pm806，Pm769，Pm0025和Pm1211篩選為假定溶血候選因子。

表6 基于基因家族主要功能及蛋白結構域的篩選

綜上，共篩選到11個假定溶血候選因子，分別為Pm0090，Pm0057，Pm0040，Pm0634，Pm1333，Pm2109，Pm2214，Pm806，Pm769，Pm0025和Pm1211。

3 討論

多殺性巴氏桿菌是一類重要的人獸共患致病菌，可引起多種動物以及人發病[23]，全世界每年因多殺性巴氏桿菌病而導致的經濟損失在數百億以上，因此研究多殺性巴氏桿菌的致病機制仍迫在眉睫。溶血素是一類能使紅細胞溶解或具有其他細胞毒性作用的生物學因子[24]，在原核生物、真核生物中均有發現。細菌溶血素可通過細胞膜損傷、細胞溶解或裂解、離子失衡相關病變、細胞凋亡、炎癥反應等參與細菌致病過程。

前期我們曾發現多殺性巴氏桿菌在厭氧條件下的溶血現象，本研究進一步對溶血現象進行驗證，證實厭氧條件下不同血清型菌株在動物紅細胞的不同培養基平板均可引起溶血，這與Hunt等人的試驗結果基本一致[25]，同時我們猜測在厭氧條件下多殺性巴氏桿菌只要能在相應的培養基上生長，最終可能都會出現溶血現象。這表明多殺性巴氏桿菌在厭氧條件下可能有其特殊的基因表達模式。研究顯示，液化沙雷氏菌(Serratialiquefaciens)胞外分泌的磷脂酶溶血素PLA1的表達可受到分別位于PLA1基因(plda1)上游50，600 bp處的雙啟動子系統的正調控，該系統分別調控該菌在生長對數期和厭氧條件下PLA1表達與分泌[26]。多殺性巴氏桿菌PmCQ2(CP033599)中同樣存在磷脂酶A1(plda1)基因(CQ2GL001693 )，該基因是否同樣受到啟動子調控以及是否與溶血現象有關，可以作為下一步溶血機制的研究。

為了探究Pm在厭氧條件下的溶血機制，本研究用TMT蛋白組學技術從蛋白水平進行分析。將多殺性巴氏桿菌厭氧組與有氧組對比，有164個蛋白表達上調，282個蛋白表達下調。溶血素作為在多種細菌中存在的毒力因子，我們猜測厭氧條件下溶血表型的出現與多殺性巴氏桿菌溶血相關因子有密切聯系，可能與某些蛋白的差異表達有關，但其機制目前還不清楚。因此，篩選假定溶血因子便顯得尤為重要。除參考在其他細菌現已報道的溶血素，從測得蛋白的注釋、基因家族功能以及本身的功能作用等方面作篩選之外，另一方面也需要從差異蛋白的差異倍數、注釋、亞細胞定位等經綜合分析后篩選一些未知蛋白。本研究一共篩選了11個假定溶血候選因子，其中Pm2109注釋為HlyC/CorC family transporter，該蛋白不僅表達上調且其蛋白結構域由未知結構域(DUF21)、CBS結構域、和轉運相關結構域(transporter)3部分組成，除與鴨疫里默氏菌(Riemerellaanatipestifer，RA)溶血素Riean_0415具有相同的蛋白結構域外[27]，還與嗜水氣單胞菌SSU(AeromonashydrophilaSSU )具有溶血活性的HlyA具有相同的蛋白結構域，并且與HlyA蛋白序列具有一定的相似性[28]。另外，Pm1211蛋白表達雖然下調，其注釋為磷脂酶，功能是脂質的轉運和代謝，研究顯示細菌磷脂酶同樣具有溶血功能[29]，但皆需要試驗驗證。當然，溶血素除了有可能是蛋白成分外，也有可能是表面活性劑物質等，像枯草芽孢桿菌的表面活性素可引起溶血[30]，假單胞菌分泌的鼠李糖脂也可以引起溶血，所以引起巴氏桿菌在厭氧條件下溶血的因素也需要進行多角度的考量和探索。

綜上，本研究基于蛋白組學分析篩選了11個候選溶血因子(Pm0090，Pm0057，Pm0040，Pm0634，Pm1333，Pm2109，Pm2214，Pm806，Pm769，Pm0025和Pm1211)，為多殺性巴氏桿菌溶血機制研究提供了參考。