鴨源沙門菌三價油乳劑滅活疫苗的制備及免疫效果

張林吉，遲 蘭，李心海，王玉燕，房 超，任士飛*

(1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221006；2.中華人民共和國徐州海關(guān)，江蘇 徐州 221003)

鴨沙門菌病(duck Salmonellosis)又稱為鴨副傷寒，是鴨的一種急、慢性傳染病，主要由于鴨感染了一種或幾種沙門菌而引起，病原菌主要包括腸炎沙門菌、鴨沙門菌和印第安納沙門菌等[1-2]。鴨沙門菌病多發(fā)生于雛鴨，3周齡內(nèi)雛鴨特別易感，感染后常呈現(xiàn)急性敗血癥，發(fā)病率和死亡率都很高[3]。成年鴨感染后不表現(xiàn)出明顯臨床癥狀，多呈現(xiàn)慢性或隱性感染，通過糞便長期排菌，但有時也會出現(xiàn)嚴重的臨床疾病，并伴有高死亡率。

鴨沙門菌病的防治主要依賴于抗菌藥物的使用，但隨著沙門菌耐藥性逐漸增強，加之大規(guī)模高密度集約化飼養(yǎng)管理造成機體免疫力降低，使得藥物治療的效果越來越差。沙門菌疫苗的研制已成此病防控技術(shù)研究的主要方向，研制出能夠有效控制鴨沙門菌病的有效疫苗，將為今后有效控制沙門菌病提供重要的工具。

目前，我國針對沙門菌疫苗的研制主要以雞和豬的沙門菌疫苗為主，而針對鴨的沙門菌疫苗較少。本研究根據(jù)徐州及周邊地區(qū)鴨源沙門菌血清型分布情況，篩選出印第安納沙門菌、阿貢納沙門菌和鴨沙門菌3株不同血清型菌株，采用傳統(tǒng)方法制備油乳滅活疫苗，評價制備疫苗的性狀；對試驗鴨進行免疫接種，從體液免疫和細胞免疫方面對免疫效果進行評價，為鴨源沙門菌疫苗的防控效果提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料印第安納沙門菌(S.indiana4∶z∶1,7)、阿貢納沙門菌(S.agona4∶f,g,s)和鴨沙門菌(S.anatum10∶e,h∶1,6)3株鴨源沙門菌為徐州動物疫病檢測中心分離鑒定并保存；胰蛋白胨和酵母浸粉購自O(shè)XOID公司；Hanks液、淋巴細胞分離液和賴氨酸等化學(xué)試劑購自南京智睿生物科技有限公司；0.5%綿羊紅細胞懸液自備；沙門菌抗體ELISA檢測試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司；ANgni乳化機購自上海昂尼儀器儀表有限公司；1日齡櫻桃谷肉鴨購自徐州佳合有限公司，隔離飼養(yǎng)于潔凈動物舍。

1.2 疫苗制備

1.2.1菌液制備及滅活 將制備菌株接種到含有300 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃培養(yǎng)18 h作為種子液，按4%比列接種到裝有6 L滅菌的沙門菌合成液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。3種菌株的發(fā)酵條件基本一致，具體參數(shù)如下：38℃通氣培養(yǎng)，攪拌速度為150 r/min；調(diào)節(jié)通氣量使溶氧指數(shù)保持40%左右，培養(yǎng)過程中滴加賴氨酸溶液，保持溶液pH值為7.3～7.6；培養(yǎng)20 h收集菌液，進行血清學(xué)檢測和雜菌檢驗，合格后，菌液離心濃縮，調(diào)整菌液濃度為120×106/mL，再加入終濃度為0.5%的甲醛滅活72 h，無菌檢驗后備用。

1.2.2疫苗乳化 滅活的混合抗原液(1∶1∶1)混合與滅菌Tween-80按照96∶4的比例混合制備成水相；白油與司本-80按照94∶6的比例混合，加入1%的硬脂酸鋁，充分攪拌混勻，121℃高壓滅菌30 min，為油相。水相和油相以1∶3的比例使用ANgni乳化機進行乳化，7 000 r/min高速勻漿2.5 min，間隔2 min，重復(fù)3次，即制備多價油乳劑滅活疫苗。

1.3 疫苗性狀檢驗劑型檢驗：觀察油乳劑滅活疫苗的外觀，將疫苗滴入盛有室溫蒸餾水的平皿表面，觀察疫苗擴散情況。如呈規(guī)則圓形則為油包水劑型，若迅速散開則為水包油劑型。穩(wěn)定性檢驗：取油乳劑滅活疫苗10 mL，3 000 r/min離心15 min，觀察其是否出現(xiàn)分層、破乳等現(xiàn)象。黏度測定：用上口徑為2.7 mm，下口徑為1.2 mm的玻璃吸管，記錄在室溫(25℃)下吸滿1 mL油乳劑滅活疫苗垂直流出0.4 mL所需的時間，重復(fù)3次取平均值。

1.4 無菌檢驗按照《中華人民共和國獸藥典》的方法[4]，將油乳劑滅活疫苗分別接種于硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、酪胨瓊脂培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，分別置于25℃培養(yǎng)7 d和37℃培養(yǎng)24 h，觀察有無微生物生長。同時，將疫苗接種到改良的Frey固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1個月，觀察有無支原體生長。

1.5 安全性檢驗取10日齡櫻桃谷雛鴨30只，每組15只，注射油乳劑滅活疫苗1 mL，一組做肌肉注射，另一組做皮下注射；另取10只不接種疫苗作為空白對照。接種之日起，觀察接種雛鴨的生長情況，接種14 d時，剖檢全部接種實驗鴨，檢查接種部位和全身臟器變化，以評價其安全性。

1.6 免疫效力檢測

1.6.1抗體水平和細胞免疫檢測 將65只10日齡櫻桃谷肉鴨分為3組，分別為空白對照組，15只，每只肌肉注射0.5 mL生理鹽水；免疫1組，25只，每只肌肉注射油乳劑滅活疫苗0.5 mL；免疫2組，25只，肌肉注射疫苗0.5 mL，7 d后，同樣劑量進行二次免疫接種。抗體水平檢測：首免疫后0，7，14，21，28，35，42，49 d采血分離血清，每組每批采10份樣品，用沙門菌抗體ELISA檢測試劑盒檢測血清中免疫抗體水平[5]。細胞免疫檢測：首免疫后，每間隔7 d采血分離鴨淋巴細胞，利用E玫瑰花環(huán)形成試驗測定不同時間鴨T淋巴細胞數(shù)量，檢測7周，具體操作參照文獻[6]。

1.6.2攻毒保護試驗 200只櫻桃谷肉鴨隨機分為空白對照組、攻毒組和免疫攻毒組，10日齡時，空白對照組和攻毒組每只肌肉注射生理鹽水0.5 mL，免疫攻毒組每只肌肉注射滅活疫苗0.5 mL；7 d后，攻毒組和免疫攻毒組進行攻毒，肌肉注射攻毒菌株，具體分組及攻毒情況見表1。攻毒后觀察記錄各組動物發(fā)病及死亡情況，觀察21 d，統(tǒng)計死亡率及存活率。

表1 分組免疫及攻毒情況

2 結(jié)果

2.1 性狀檢驗制備的油乳劑滅活疫苗為白色乳液，鏡檢質(zhì)地均一，無顆粒狀雜質(zhì)，漂浮于蒸餾水表面，呈規(guī)則圓形，邊緣圓滑規(guī)整，表明該制劑為油包水劑型。疫苗經(jīng)3 000 r/min離心15 min后，沒有出現(xiàn)分層、破乳現(xiàn)象，疫苗穩(wěn)定性良好。疫苗自然垂直流出0.4 mL的平均時間為4.83 s (4.7，5.1，4.6 s)，符合油乳劑滅活疫苗的黏度要求(2～8 s)。

2.2 無菌檢驗將油乳劑滅活疫苗接種到各培養(yǎng)基，經(jīng)培養(yǎng)后無細菌、霉菌及支原體等微生物生長，疫苗無菌檢驗合格。

2.3 安全性檢驗疫苗接種當(dāng)日，接種雛鴨表現(xiàn)出輕微的臨床癥狀，與對照組相比，采食量減少了30%左右，飲水減少了10%～15%，運動量明顯減少，喜臥，至接種后2 d，皮下和肌肉接種組的實驗鴨精神飲食逐漸恢復(fù)正常。第14天剖殺，皮下注射組實驗鴨注射部位殘存少量未吸收的疫苗液體，肌肉注射組疫苗吸收良好，未見殘留。觀察期內(nèi)3組實驗鴨全部健康存活，無明顯臨床癥狀。

2.4 免疫效力檢測

2.4.1抗體水平檢測結(jié)果 由圖1可見，免疫后7 d，免疫組抗體水平逐漸升高，免疫1組和免疫2組分別于免疫后21，35 d抗體水平達到峰值，然后開始緩慢降低。免疫后1周，免疫1組與空白對照組的抗體水平存在統(tǒng)計學(xué)差異(P≤0.05)，21 d為極顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P≤0.01)，35 d后2組之間的抗體水平未見統(tǒng)計學(xué)差異；免疫后7～14 d，免疫2組與空白對照組的抗體水平存在統(tǒng)計學(xué)差異(P≤0.05)，至免疫后49 d時依然維持在較高水平，抗體水平存在極顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P≤0.01)。

空白對照組與免疫1組比較，#P≤0.05，##P≤0.01；空白對照組與免疫2組比較，*P≤0.05，**P≤0.01。下同

2.4.2E玫瑰花環(huán)檢測結(jié)果 E玫瑰花環(huán)形成試驗檢測T淋巴細胞結(jié)果顯示，免疫后7 d，免疫1組和免疫2組的E玫瑰花環(huán)形成率開始高于空白對照組，統(tǒng)計學(xué)差異(P≤0.05)， 14～49 d有極顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P≤0.01)，具體結(jié)果見表2。

表2 E玫瑰花環(huán)形成率檢測結(jié)果 %

2.4.3攻毒保護試驗結(jié)果 觀察雛鴨臨床表現(xiàn)，攻毒組和免疫攻毒組的雛鴨在攻毒后24 h左右出現(xiàn)食欲降低、懼寒扎堆和嗜睡等臨床表現(xiàn)，36 h開始陸續(xù)出現(xiàn)死亡。空白對照組未見臨床癥狀，無死亡；攻毒5,6，8組于攻毒后第1周內(nèi)全部死亡，攻毒7組死亡19只，存活1只；免疫攻毒1組和4組都死亡3只，存活22只，免疫攻毒2組死亡2只，存活23只，免疫攻毒3組全部存活，具體各組的死亡率和存活率結(jié)果見表3。

表3 免疫攻毒試驗結(jié)果

3 討論

由于沙門菌血清型多達2 500多種，很難確定作為標準的沙門菌疫苗菌株，因此根據(jù)不同地區(qū)流行的沙門菌株，研制成滅活疫苗是有效預(yù)防沙門菌病的重要技術(shù)關(guān)鍵，通常可以收到良好的預(yù)防效果[7]。本試驗結(jié)果顯示，通過對鴨沙門菌多價滅活疫苗的各項檢驗，證明疫苗無菌檢驗、物理性狀等指標符合要求。

疫苗的免疫效果通常包括抗體免疫水平和細胞免疫水平。本研究通過檢測血清中抗體水平的變化規(guī)律來反應(yīng)抗體免疫水平，檢測結(jié)果顯示空白對照組的雛鴨在10日齡免疫時依然保持一定的母源抗體水平，隨日齡增長其母源抗體逐漸下降，這與金大春等[8]研究結(jié)果基本相符合，因此在制定免疫程序時要考慮母源抗體對免疫效果的影響。免疫1組在免疫后的21 d達到最高水平，之后開始緩慢降低，在免疫后的35 d與空白對照組沒有統(tǒng)計學(xué)差異；免疫2組在間隔7 d后進行二次免疫，在35 d到達最高，其抗體水平遠遠高于免疫1組，免疫后7周，抗體水平依然高于免疫1組的最高水平，與空白對照組依然有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果顯示，疫苗免疫可以刺激雛鴨產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，二次免疫抗體水平要遠高于一次免疫，推測可能是由于母源抗體的作用導(dǎo)致一次免疫效果的降低。

外周血T淋巴細胞在疫苗抗原的刺激下，可以提高其自身的活性，免疫1組和免疫2組的E玫瑰花環(huán)形成率明顯高于空白對照組，2個免疫組之間沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明，疫苗免疫可以提高鴨外周T淋巴細胞的數(shù)量，增強雛鴨的細胞免疫水平。

沙門菌滅活疫苗的免疫效果不如減毒或無毒載體等口服活疫苗，但是由于沙門菌的毒力因子很多，減毒疫苗是否會發(fā)生毒力恢復(fù)或返強，其安全性還有待進一步研究證實[9-10]。由于徐州及周邊地區(qū)，近年來從病鴨分離的沙門菌主要為印第安納沙門菌、阿貢納沙門菌和鴨沙門菌3種鴨源沙門菌，所以本研究以3種菌株制備多價滅活疫苗，研究結(jié)果表明，多價滅活疫苗可以對強毒株攻菌獲得很高的存活率，對鴨沙門菌攻毒保護率可以達到100%，對阿貢納沙門菌攻毒保護率為90%，對印第安納沙門菌及3種混合菌株的攻毒保護率可以達到87%，證明該疫苗具有實質(zhì)性的免疫預(yù)防作用，這些研究結(jié)果與國內(nèi)一些研究結(jié)果是一致的[11-13]。但是，動物保護試驗結(jié)果顯示存活率還有待進一步地提高，尤其是對毒性較強印第安納沙門菌和多種聯(lián)合菌株的攻毒感染，因此制定合理的免疫程序和聯(lián)合免疫，以及攻毒后的聯(lián)合防制是下一步研究的重點工作。

本研究以徐州地區(qū)主要流行的鴨源沙門菌制備油乳滅活疫苗，其各項指標達到要求，且安全可靠。外周血抗體檢測結(jié)果顯示二次免疫優(yōu)于單次免疫，二免抗體水平逐漸持續(xù)上升，遠高于單次免疫，并在較長時間內(nèi)維持平穩(wěn)的抗體水平；疫苗免疫可以刺激雛鴨產(chǎn)生一定程度的細胞免疫反應(yīng)，多價滅活疫苗可以有效保護鴨源沙門菌單菌株或多個混合菌株對雛鴨的感染，對動物的保護率可以達到87%～100%。