山羊支原體山羊肺炎亞種在2種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性比較

張曉亮，馬水燕，郝華芳，陳勝利，顏新敏，馬麗娜，劉永生，儲(chǔ)岳峰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae, Mccp)是引起山羊傳染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia, CCPP)的病原體[1]，于1976年首次在肯尼亞成功分離得到[2]，我國(guó)于2007年分離出1株[3]。CCPP是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)所列必須法定報(bào)告的疫病之一[4]，對(duì)山羊養(yǎng)殖業(yè)危害嚴(yán)重，山羊感染該病無(wú)年齡和性別差異，以發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、纖維素性肺炎和胸膜炎為主要特征[5]。近年來(lái)，該病的報(bào)道逐漸增多，流行范圍擴(kuò)大，對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重影響[6-7]，特別是近年來(lái)有Mccp感染藏羚羊和阿拉伯羚羊等野生有蹄類動(dòng)物傳播的報(bào)道[8-9]，該病對(duì)無(wú)病地區(qū)和野生動(dòng)物的威脅越來(lái)越值得關(guān)注，因此有效預(yù)防控制Mccp感染成為亟需解決的問(wèn)題。

疫苗免疫是預(yù)防控制CCPP發(fā)生的一個(gè)重要手段[10]。自1976年證實(shí)Mccp是CCPP病原以來(lái)，Mccp菌體滅活疫苗的研究已在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)研制成功并商品化使用[10]。但Mccp培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)要求苛刻，除基礎(chǔ)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還需加入一定量的動(dòng)物血清從而提供支原體生長(zhǎng)代謝過(guò)程中必需的膽固醇物質(zhì)。目前常用的培養(yǎng)基中血清含量普遍在20%，且Mccp存在生長(zhǎng)時(shí)間長(zhǎng)、活菌滴度低等問(wèn)題，不僅使疫苗生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)工藝復(fù)雜，也增加了異源血清對(duì)羊體過(guò)敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重限制了CCPP疫苗的推廣應(yīng)用。因此開(kāi)發(fā)生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高、成本低的適合Mccp制苗用的培養(yǎng)基成為CCPP疫苗研究和生產(chǎn)中急需解決的問(wèn)題。本試驗(yàn)針對(duì)目前常用培養(yǎng)基中的不足，研制了一種低血清培養(yǎng)基，測(cè)定了Mccp 2個(gè)疫苗用菌株在2種不同支原體培養(yǎng)基中的活菌滴度曲線和蛋白濃度，為下一步改進(jìn)CCPP滅活疫苗生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本、提高安全性和有效性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑PPLO Broth(購(gòu)自BD公司)、丙酮酸鈉(購(gòu)自Macklin公司)、滅活馬血清(購(gòu)自Gibco)、酚紅(購(gòu)自Sigma公司)、青霉素、葡萄糖、酵母浸出液等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭CA蛋白定量試劑盒(購(gòu)自Thermo公司)。

1.2 菌株和培養(yǎng)基山羊支原體山羊肺炎亞種M1801株與M1601株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室保存。

改良Thiaucourt’s肉湯培養(yǎng)基(MTB)配方：PPLO Broth(21 g/L)、25%酵母浸出液(100 mL/L)、丙酮酸鈉(2 g/L)、葡萄糖(2 g/L)、1% 酚紅(2.5 mL/L)、馬血清(200 mL/L)、青霉素(10萬(wàn)IU/L)，用1mol/L NaOH將pH調(diào)至7.4左右。

5%馬血清HF3培養(yǎng)基含馬血清(50 mL/L)、1% 酚紅(2.5 mL/L)、青霉素(5萬(wàn)IU/L)等成分，用1 mol/L NaOH將p H調(diào)至7.4左右，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所國(guó)家重點(diǎn)試驗(yàn)室配制保存。

1.3 菌液的培養(yǎng)將凍存的Mccp M1801和M1601菌株與培養(yǎng)基以1∶9的比例無(wú)菌操作接種于4.5 mL上述2種不同的液體培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)箱復(fù)蘇。待培養(yǎng)基變黃后，分別連續(xù)傳代3次，待其生長(zhǎng)穩(wěn)定之后，將菌液與2種培養(yǎng)基按照相同的比例再傳代，作為待測(cè)菌液，置37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

1.4 顏色變化和pH值測(cè)定在待測(cè)菌液0，6，12，18，24，36，48，72，96和120 h取樣，取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌液1 mL于15 mL離心管內(nèi)，用pH計(jì)測(cè)定菌液的pH值，并觀察顏色變化。

1.5 CCU的測(cè)定對(duì)待測(cè)菌液的0，6，12，18，24，36，48，72，96和120 h樣品進(jìn)行CCU測(cè)定。取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別將2種培養(yǎng)基以每孔180 μL的量分裝，第1孔加入待測(cè)菌液20 μL，吹打均勻后，吸取20 μL加入第2孔，依次重復(fù)以上操作至第10孔，吹打混勻后吸取20棄去，由此，待測(cè)菌液被稀釋成10-10～10-1不同的稀釋倍數(shù)，隔開(kāi)第11孔，第12孔為空白培養(yǎng)基對(duì)照。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別做8個(gè)平行孔，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于濕盒內(nèi)，37℃溫箱培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基的顏色變化，直至顏色不發(fā)生變化為止，根據(jù)MPN表確定待測(cè)菌液的生長(zhǎng)滴度，用CCU表示，最后以取樣時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，logCCU為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6 蛋白濃度的測(cè)定取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌液1 mL于EP管內(nèi)，―40℃凍存。待所有CCU測(cè)定完成后，取出菌液后12 000 r/min離心10 min，將上清棄去，吸取適量0.85%生理鹽水吹打沉淀使其懸浮混勻，12 000 r/min離心10 min后以同樣的方法洗滌4次，離心后棄去上清，用200 μL PBS懸浮沉淀，最后用BCA蛋白定量分析試劑盒測(cè)定相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的蛋白濃度。以取樣時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，菌液蛋白濃度為縱坐標(biāo)，繪制蛋白濃度曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基顏色及pH值變化結(jié)果用1 mol/L的NaOH將配制的2種液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)至7.4左右，發(fā)現(xiàn)HF3的顏色要比MTB的偏黃一些(圖1)。待2種培養(yǎng)基上的菌液在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～3 d，顏色不再變化時(shí)，比較發(fā)現(xiàn)MTB培養(yǎng)基顏色變化更為明顯(圖2)。待傳代到F4代后，測(cè)定以上10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的pH值變化(圖3)，發(fā)現(xiàn)2個(gè)菌株在MTB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)pH值下降速度比在HF3培養(yǎng)基更快。

圖1 2種培養(yǎng)基顏色比較

圖2 2種培養(yǎng)基培養(yǎng)Mccp后顏色變化

圖3 M1801與M1601在2種培養(yǎng)基中pH值變化曲線

2.2 CCU的測(cè)定結(jié)果根據(jù)支原體CCU測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，測(cè)定10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的CCU，發(fā)現(xiàn)M1801在MTB中0～48 h CCU基本維持在1.40×109～1.42×1010CCU/mL，之后逐漸下降，而在HF3中0～72 h CCU都能維持在1.40×109～2.14×1010CCU/mL，之后才逐漸下降；同時(shí)，觀測(cè)發(fā)現(xiàn)M1601在MTB中0 ～72 h CCU基本維持在2.91×109～1.26×1010CCU/mL，然后逐漸下降，而在HF3中0 ～96 h CCU基本維持在1.06×109～1.42×1010CCU/mL，之后才出現(xiàn)下降趨勢(shì)。可見(jiàn)在HF3中，Mccp維持較高滴度的時(shí)間更長(zhǎng)。

2.3 蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定結(jié)果測(cè)定10個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)量濃度，發(fā)現(xiàn)M1801在MTB中0～96 h蛋白質(zhì)量濃度從18.03 mg/L一直增長(zhǎng)到103.64 mg/L，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在HF3中0～72 h蛋白質(zhì)量濃度從22.37 mg/L一直增長(zhǎng)到172.16 mg/L；同樣，M1601在MTB中0～72 h蛋白質(zhì)量濃度從23.60 mg/L 一直增長(zhǎng)到138.64 mg/L，之后逐漸下降，在HF3中0～96 h蛋白質(zhì)量濃度從31.21 mg/L一直增長(zhǎng)到184.21 mg/L,隨后開(kāi)始下降。初步說(shuō)明，在HF3中，Mccp2種菌株的菌體蛋白質(zhì)量濃度均有所提高。

圖4 M1801與M1601在2種培養(yǎng)基中l(wèi)og CCU變化曲線

圖5 M1801與M1601在2種培養(yǎng)基中蛋白濃度變化曲線

3 討論

目前，預(yù)防 Mccp 感染的主要措施是使用滅活疫苗進(jìn)行免疫[11]，又因?yàn)橐呙缰锌乖暮渴菦Q定滅活疫苗免疫效力的主要因素之一，準(zhǔn)確掌握制苗菌株的生長(zhǎng)曲線是疫苗生產(chǎn)工藝的重要環(huán)節(jié)，據(jù)此才能獲得最高的抗原產(chǎn)量[12-13]。菌體蛋白含量是CCPP滅活疫苗研制過(guò)程中常用的抗原定量技術(shù)，但培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，活菌滴度又會(huì)下降，導(dǎo)致抗原中死細(xì)胞過(guò)多，影響抗原質(zhì)量。因此活菌滴度和菌體蛋白含量綜合評(píng)價(jià)才能獲得最佳的抗原收獲時(shí)間。另一方面，由于Mccp營(yíng)養(yǎng)要求高且生長(zhǎng)緩慢，導(dǎo)致CCPP滅活疫苗生產(chǎn)重存在抗原產(chǎn)量低、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高等缺陷，使得CCPP滅活疫苗難以得到推廣。因此，急需研發(fā)CCPP產(chǎn)量高且成本低的制苗用培養(yǎng)基。

為驗(yàn)證Mccp菌株新改良培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，測(cè)評(píng)其效果，從而篩選出適合大批量制作滅活疫苗的培養(yǎng)基。本試驗(yàn)以酚紅作為指示劑，利用Mccp在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分解葡萄糖產(chǎn)酸，使得培養(yǎng)基顏色變黃，據(jù)此比較Mccp菌株在MTB和HF32種液體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。結(jié)果表明，Mccp M1801和M1601在HF3培養(yǎng)基中pH下降更慢，活菌滴度也高于MTB培養(yǎng)基，且平臺(tái)期維持時(shí)間更長(zhǎng)，在培養(yǎng)120 h后仍有較多活菌數(shù)。HF3培養(yǎng)基培養(yǎng)的蛋白濃度也略高于MTB，在本次試驗(yàn)中，M1801在HF3中培養(yǎng)時(shí)的收獲時(shí)間應(yīng)控制在72 h之前，72 h 后菌體進(jìn)入衰亡期，并且由于pH過(guò)低，蛋白含量也急劇下降。同理，M1601在HF3中培養(yǎng)時(shí)應(yīng)控制在96 h之前收獲菌體由此可初步說(shuō)明HF3培養(yǎng)基更有利于Mccp的生長(zhǎng)，可用于滅活疫苗生產(chǎn)過(guò)程中菌體的培養(yǎng)，從而使成本更為低廉。

支原體在體外培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)條件較其他細(xì)菌要求更高，除了供給所必需的膽固醇和酵母等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還要添加一定的馬血清或小牛血清，所以培養(yǎng)基成本較為昂貴，這使得大批量制苗的成本大大提高。目前常用的Mccp培養(yǎng)基血清含量普遍在20%，本試驗(yàn)根據(jù)Mccp的生長(zhǎng)特性，對(duì)不同的碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行優(yōu)化篩選，新研制的培養(yǎng)基HF3僅含5%馬血清，同時(shí)添加了一些促進(jìn)支原體代謝、促進(jìn)蛋白質(zhì)、脂類等合成的成分和一些生長(zhǎng)所需氨基酸，不僅使培養(yǎng)基成本降低50%左右，活菌滴度和抗原產(chǎn)量還有所提高，且減少了異源血清引起的免疫干擾因素，為降低Mccp培養(yǎng)基成本，改進(jìn)Mccp疫苗質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

當(dāng)然，本試驗(yàn)在測(cè)定生長(zhǎng)曲線時(shí)，由于初始菌液未稀釋，0 h時(shí)接種的菌液濃度過(guò)高，所以繪制的曲線沒(méi)有明顯的遲緩期和對(duì)數(shù)期，不能明確體現(xiàn)Mccp的生長(zhǎng)曲線特征。但在目前CCPP滅活疫苗生產(chǎn)過(guò)程中培養(yǎng)菌液的接種量為10%，所以本次試驗(yàn)在接種量上是符合實(shí)際情況的。另一方面，本次試驗(yàn)所測(cè)得的生長(zhǎng)曲線是在實(shí)驗(yàn)室階段通過(guò)小批量培養(yǎng)測(cè)得的數(shù)據(jù)，可作為規(guī)模山羊支原體山羊肺炎亞種的培養(yǎng)或發(fā)酵罐生產(chǎn)的參考依據(jù)，但擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模后的生長(zhǎng)情況尚待進(jìn)行進(jìn)一步研究，從而獲得更準(zhǔn)確直接的數(shù)據(jù)和結(jié)論。另外，本次試驗(yàn)是驗(yàn)證HF3改良培養(yǎng)基培養(yǎng)效果的初步試驗(yàn)，試驗(yàn)方案中未進(jìn)行菌株免疫原性檢測(cè)，在后續(xù)試驗(yàn)中，將進(jìn)一步研究培養(yǎng)基成分的變化是否導(dǎo)致了菌體免疫原性的變化，對(duì)改良培養(yǎng)基的有效性進(jìn)行檢驗(yàn)。