犬瘟熱病毒(CDV) RPA-SYBR GreenⅠ 檢測方法的建立與應(yīng)用

郝 鐲，張珊珊，李 楠，田 多，李吉平，孟軻音，萬忠海，穆玉堂，李忠義，王承宇

(軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所/吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室，吉林 長春 130122)

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(CDV)引起的一種高度傳染性傳染病，在犬及野生肉食動物中廣泛傳播，是危害犬及毛皮經(jīng)濟動物的主要疫病之一，給寵物業(yè)和毛皮動物產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟影響[1]。目前對CDV的檢測方法主要有ELISA、半定量PCR、LAMP等[2]，這些方法靈敏度高，特異性好，但是反應(yīng)時間長，對實驗操作人員的技術(shù)水平和儀器精密度要求高，不適于獸醫(yī)臨床或野外現(xiàn)場檢測。膠體金檢測試紙條的方法雖然簡便快速，但靈敏性較低，且容易出現(xiàn)假陽性，因此不適合患病動物的早期診斷。

重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification，RPA)是一種恒溫核酸擴增技術(shù)，按照RPA反應(yīng)要求設(shè)計上下游引物，根據(jù)不同的RPA產(chǎn)物檢測方法設(shè)計不同的檢測探針。RPA反應(yīng)包含3種核心酶即重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換多聚異構(gòu)酶，它們協(xié)調(diào)引物配對靶向RNA/DNA合成DNA，短時間內(nèi)將核酸模板從痕量水平擴增到可檢測水平，具有高敏感性和特異性[3]，非常適于獸醫(yī)臨床的早期診斷。SYBR Green Ⅰ是一種可結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green Ⅰ發(fā)出微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA結(jié)合聚集后，熒光大大增強。由于RPA引物標(biāo)記FAM基團(tuán)，因此擴增的靶標(biāo)產(chǎn)物與SYBR Green Ⅰ結(jié)合后可產(chǎn)生熒光綠色沉淀復(fù)合物，非靶標(biāo)產(chǎn)物與SYBR Green Ⅰ結(jié)合后只顯現(xiàn)核酸染料的原始顏色，即為紅褐色，RPA擴增產(chǎn)物與SYBR Green Ⅰ結(jié)合使結(jié)果可通過肉眼觀察，所以適用于臨床及野外檢測[1]。近年來，RPA檢測方法已經(jīng)成功應(yīng)用于多種動物疫病病原的快速檢測，如小反芻動物獸疫、植物病毒等。本研究的目的是將RPA和SYBR Green Ⅰ結(jié)合，建立一種CDV核酸檢測方法，可以對犬瘟熱進(jìn)行早期、準(zhǔn)確、快速診斷。

1 材料與方法

1.1 主要病原CDVOnderstepoort株(CDV-GZ1)，犬細(xì)小病毒(CPV)，犬腺病毒(CAV)，犬副流感病毒(CPIV)，CDV第10代毒株(CDV-10)，Vero細(xì)胞，由軍事獸醫(yī)研究所病毒室提供，臨床檢測樣本由長春西諾生物提供，-80℃留存待用。

1.2 主要試劑TwistAmp nfo試劑盒購自 TwistDx公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；SYBR Green Ⅰ購自Solarbio公司；ELISA檢測試劑盒購自上海紀(jì)寧生物技術(shù)有限公司；其他未提及試劑均購自Sigma公司。

1.3 主要儀器臺式高速離心機，購自德國Sigma公司；干式恒溫器，購自金壇市白塔金昌實驗儀器廠；Nano Drop、酶標(biāo)儀，購自上海賽默飛世爾公司；熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司；漩渦儀，購自德國IKA公司。

1.4 引物設(shè)計根據(jù)GenBank中收錄的CDV基因序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行對比與分析，篩選出N基因序列中同源性相對較高的保守區(qū)，根據(jù)RPA引物設(shè)計原則，利用軟件Primer Explore 3.0在線針對靶基因設(shè)計RPA上下游引物(P1、P2)和1條探針(T)，RT-PCR引物序列參照四川省地方標(biāo)準(zhǔn)DB51/T 1710.2—2013，序列見表1。

表1 引物序列信息

1.5 模板的制備取實驗室培養(yǎng)的CDV細(xì)胞培養(yǎng)上清液200 μL，按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書提取病毒總RNA，并取部分樣品檢測RNA質(zhì)量，D260/D280值為1.8～2.0，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80℃留存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 CDV RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法的建立使用上述引物，按照TwistAmp nfo試劑盒說明，以cDNA為模板進(jìn)行RPA反應(yīng)，得到擴增產(chǎn)物。反應(yīng)體系50 μL，其中P1(10 μmol/L)2.10 μL、P2(10 μmol/L)2.10 μL、T(10 μmol/L)1.05 μL、無引物緩沖液 29.50 μL、模板4.00 μL、醋酸鎂(280 mmol/L)2.50 μL 、滅菌超純水8.75 μL。設(shè)置陽性對照(PC)為CDV-GZ1病毒總RNA，陰性對照(NC)為Vero細(xì)胞的總RNA，空白對照(BC)為DMEM培養(yǎng)基，反應(yīng)條件和體系按RPA反應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行[3-5]，每個反應(yīng)至少重復(fù)3次。之后在擴增產(chǎn)物中加入SYBR Green Ⅰ，避光靜置5 min后讀取結(jié)果。

1.7 CDV RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法反應(yīng)條件優(yōu)化將試驗組按不同溫度共分為5組(25，30，35，39，40℃)，確定最佳反應(yīng)溫度。確定反應(yīng)溫度后，將試驗組按不同反應(yīng)時間共分為9組(5，6，8，10，12，14，16，18，20 min)，確定最佳反應(yīng)時間。

1.8 CDV RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法反應(yīng)體系優(yōu)化將試驗組按照不同的引物和探針比例分為7組(1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1，3∶1，3.5∶1，4∶1)確定引物與探針的最佳環(huán)比；在陽性對照組中加入不同體積的SYBR Green Ⅰ(1.0，0.9，0.8，0.7，0.6，0.5，0.4，0.3，0.2，0.1 μL)，確定SYBR Green Ⅰ的最佳反應(yīng)含量，反應(yīng)體系、引物濃度和探針濃度則按照TwistAmp nfo試劑盒說明進(jìn)行篩選。

1.9 CDV RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法的靈敏性分析用DMEM培養(yǎng)基將1×105TCID50/mL的 CDV細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別提取1×105～1×10-2TCID50/mL 8個樣品的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用優(yōu)化后的RPA-SYBR Green Ⅰ反應(yīng)條件和體系進(jìn)行靈敏性試驗，并與ELISA方法進(jìn)行比較。

1.10 CDV RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法的特異性分析提取CDV、CDV-10、CPIV的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；提取CPV、CAV的總DNA，采用優(yōu)化后的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行RPA擴增反應(yīng)，驗證RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法的特異性。

1.11 CDV RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法的臨床應(yīng)用分別用RPA-SYBR Green Ⅰ、ELISA和RT-PCR方法對臨床上采集的22份病犬臨床樣本進(jìn)行CDV檢測。

2 結(jié)果

2.1 CDV RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法反應(yīng)條件優(yōu)化RPA反應(yīng)原理是通過寡核苷酸引物特異性地識別模板靶位點的序列，隨后發(fā)生DNA鏈的置換合成，從而使模板的靶區(qū)域呈指數(shù)擴增，因此我們根據(jù)擴增產(chǎn)物的多少來確定最佳的反應(yīng)條件。如圖1A所示，在5組不同反應(yīng)溫度的試驗組中，35℃組及之后分組的擴增產(chǎn)物加入SYBR Green Ⅰ后顏色均變成熒光綠包，且顏色幾乎沒有深淺變化，因此確定最佳反應(yīng)溫度為35℃；圖1B結(jié)果顯示，閉合手掌組(FC)的擴增產(chǎn)物加入SYBR Green Ⅰ后顏色同陽性對照組一致，均為熒光綠色，呈陽性結(jié)果，證明手掌中的溫度可以啟動RPA反應(yīng)，因此后續(xù)RPA試驗均在實驗人員閉合手掌中啟動；圖1C結(jié)果表明RPA反應(yīng)10 min后即可將痕量水平的靶標(biāo)擴增到可檢測水平，因此確定最佳反應(yīng)時間為10 min。

A.反應(yīng)溫度；B.閉合手掌溫度啟動RPA反應(yīng)；C.RPA反應(yīng)時間

2.2 CDV RPA-RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法反應(yīng)體系優(yōu)化根據(jù)RPA試劑盒說明本試驗采用50 μL 反應(yīng)體系，引物和探針的最佳濃度均為10 μmol/L；如圖2A中所示，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件確定上下游引物與探針的最佳環(huán)比，其中2∶1組及以后各組同陽性對照一致，均為熒光綠色，本著操方便，節(jié)約成本的原則，我們確定引物與探針的最佳反應(yīng)環(huán)比為2∶1；如圖2B中所示，只有在陽性對照的擴增產(chǎn)物中加入0.1 μL的SYBR Green Ⅰ才可以與之發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生熒光綠色的復(fù)合物，因此確定SYBR Green Ⅰ的加入量為0.1 μL。

A.引物與探針環(huán)比；B.SYBR GreenⅠ加入量

2.3 CDV RPA-RPA-SYBR Green Ⅰ反應(yīng)靈敏性分析本試驗的靈敏性通過在最優(yōu)反應(yīng)條件下對1×105～1×10-1TCID50/mL的CDV細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行RPA-SYBR Green Ⅰ檢測來分析該方法的的靈敏性。結(jié)果如圖3顯示，1×105～1×101組的擴增產(chǎn)物與SYBR Green Ⅰ結(jié)合后均為熒光綠色，但顏色逐漸變淺，1×10-1TCID50/mL組開始有一點紅褐色出現(xiàn)，但沒有1×10-2TCID50/mL組顏色深，說明RPA-SYBR Green Ⅰ方法的檢測下限應(yīng)該在1×101～1×100TCID50/mL。圖3顯示，ELISA檢測方法在1×101～1×104TCID50/mL具有很好的線性關(guān)系(R2=0.963 9)，經(jīng)計算ELISA對CDV的最低檢測下限為6.17 TCID50/mL，RPA-SYBR Green Ⅰ與ELISA檢測方法的檢測下限幾乎一致，說明RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法具有良好的靈敏性。

圖3 CDV RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法靈敏度分析結(jié)果

2.4 CDV RPA-SYBR Green Ⅰ反應(yīng)特異性分析分別提取CDV、CDV第10代病毒(CDV-10)、CPV、CAV、CPIV 的總RNA/DNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA之后，進(jìn)行RPA擴增反應(yīng)，結(jié)果如圖4顯示只有CDV、CDV-10細(xì)胞培養(yǎng)液和陽性對照與SYBR Green Ⅰ結(jié)合后為熒光綠色，呈陽性結(jié)果，其他病毒均為紅褐色，呈陰性結(jié)果，證明了本檢測方法具有良好的特異性。

圖4 CDV RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法特異性分析

2.5 CDV RPA-SYBR Green Ⅰ檢測方法的臨床應(yīng)用分別用CDV RPA-SYBR Green Ⅰ、ELISA和RT-PCR方法檢測臨床采集病犬的22份樣品，結(jié)果顯示3種方法的檢測結(jié)果一致，一致率達(dá)到100%，證明CDV RPA-SYBR Green Ⅰ可應(yīng)用于臨床樣本CDV的檢測(圖5，表2)。

表2 CDV PRA-SYBR Green Ⅰ與ELISA和RT-PCR方法檢測臨床樣本結(jié)果比較

樣品順序為箭頭方向依次排列，前2個紅褐色EP管為NC組與BC組，其余均是臨床樣本，與表2中順序一致。

3 討論

犬瘟熱傳染性極強，可感染全世界的野生和家養(yǎng)犬科動物，具有跨物種感染潛力，其發(fā)病速度快致死率極高，可高達(dá)90%以上，主要臨床癥狀為消化道障礙、呼吸道疾病、鼻炎、發(fā)熱，個別可發(fā)生腦炎等[6-11]。犬瘟熱早期診斷方法主要為觀察法，即觀察犬及其他動物的反應(yīng)癥狀，之后又陸續(xù)出現(xiàn)熒光定量PCR、ELISA、半定量PCR、免疫切片等方法[10-11]，但是這些方法對檢測人員有很高的要求，且需要一些精密的高端儀器設(shè)備，例如免疫切片等方法耗時長，結(jié)果也差強人意，因此，開發(fā)一種新型、快速、敏感、特異，能在基層獸醫(yī)站等領(lǐng)域普遍應(yīng)用的犬瘟熱檢測方法，對于犬瘟熱的早期診斷和綜合防控具有重要意義。

本試驗結(jié)合RPA與SYBR Green Ⅰ 建立了一種CDV RPA-SYBR Green Ⅰ 檢測方法[13-15]。該方法操作簡單，只需恒溫操作(閉合手掌中溫度反應(yīng)10 min)，5 min內(nèi)即可獲得檢測結(jié)果，不需要PCR儀等精密儀器，對操作人員要求較低。RPA檢測原理是核酸互補配對原理，該原理使靈敏性和特異性顯著提高，很好地克服了市售犬瘟熱膠體金試紙條假陽(陰)性問題[16]，在手掌中即可進(jìn)行擴增反應(yīng)或者保溫杯中進(jìn)行，非常方便，適合野外非正常試驗環(huán)境進(jìn)行CDV的檢測。經(jīng)過本實驗室多次重復(fù)試驗，結(jié)果無差異，且與ELISA、RT-PCR方法檢測結(jié)果一致，說明此方法可信度高，可用于犬瘟熱診斷。

RPA試驗最重要且最關(guān)鍵的是引物和探針的設(shè)計，本試驗共設(shè)計了10套引物，共有3套可以啟動擴增反應(yīng)，但只有1套引物的特異性良好，可見有效的引物才能確保試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時可以調(diào)整探針的設(shè)計，針對不同實驗條件對擴增結(jié)果的輸出方式進(jìn)行改變，如可以與核酸檢測橫向流動試紙條(LFD)結(jié)合，變成試紙條輸出方式，使得結(jié)果可視化。RPA對時間和溫度的要求也很敏感，反應(yīng)溫度和時間過高過長或者過低過短均可對整個試驗造成根本性的影響，因此在不同的試驗條件下一定要對試驗的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行優(yōu)化，以達(dá)到最好的檢測靈敏性和特異性。本試驗將RPA與SYBR Green Ⅰ結(jié)合，將待測靶標(biāo)信號放大，短時間內(nèi)使結(jié)果可視化[17-18]，為建立高靈敏性和特異性的靶標(biāo)檢測方法提供了新思路，為犬瘟熱的臨床診斷提供技術(shù)基礎(chǔ)。

綜上所述，CDV RPA-SYBR Green Ⅰ可以實時、準(zhǔn)確、快速地檢測出動物機體組織、黏液、細(xì)胞等中的CDV，對于開發(fā)新型CDV初期檢測方法具有很好的應(yīng)用前景。