雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯滅活疫苗的安全性和有效性

劉月月，侯瑞卿，張盼濤，段佳蕾，王同燕，郭麗霞，盛東北，袁 月，劉武杰*，田克恭*

(1.國家獸用藥品工程技術研究中心，河南 洛陽 471000；2.洛陽惠中生物技術有限公司，河南 洛陽 471000)

雞新城疫(ND)是由雞新城疫病毒(NDV)引起的一種烈性傳染病，病雞常常表現為精神沉郁、嗜睡、頭頸、尾部節律性震顫，傳播迅速、死亡率較高，全世界大部分國家和地區均流行[1-2]。雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的急性呼吸道傳染病，所有日齡雞均可感染，可侵害呼吸道、泌尿生殖道及消化道，可引起肉雞增重緩慢、蛋雞產蛋率下降[3-5]。禽流感(AI)亞型眾多，是危害我國養禽業的重要疾病，雖然H9亞型禽流感致病力不高，但雞群感染后往往影響其產蛋性能，且易引發繼發感染，加上病毒易變異，使得時常引起雞群感染[6-14]。這3種疾病對養禽業造成重大經濟損失，目前疫苗免疫仍然是預防這3種傳染病的重要措施。

研究表明，21世紀以來，基因Ⅶ型NDV已逐漸成為雞群中的流行優勢毒株[15-18]，但目前已經上市的ND相關的滅活疫苗和活疫苗使用的疫苗株多為基因Ⅱ型的La Sota株。疫苗株與流行株之間基因型匹配性關系著疫苗對雞群的保護效果[19]，因此基因Ⅶ型ND疫苗的研究迫在眉睫。近年來，本研究從臨床分離了多株的基因Ⅶ型NDV毒株，其中PLK-N-06株免疫原性好，但毒力強，不宜作為疫苗株直接使用。通過反向遺傳技術將PLK-N-06株致弱，獲得N7a株疫苗株，前期研究結果顯示，N7a株免疫原性好、毒力弱，是理想的疫苗候選株。我們對H9亞型(AIV)進行了持續的流行病學調查，從大量的臨床分離株中篩選到1株交叉保護性較好的毒株—A/Chicken/Shandong/SZ/2008(H9N2)株(簡稱“SZ株”)，可作為理想的疫苗候選株，用于滅活疫苗的研制。

本研究中，我們使用NDV N7a株、H9 AIV SZ株連同IBV經典疫苗株M41株制備的ND、IB、AI(H9亞型)三聯滅活疫苗，分別免疫肉雞和蛋雞進行安全性和有效性評價。

1 材料與方法

1.1 疫苗雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯滅活疫苗(N7a株+M41株+SZ株)由普萊柯生物工程股份有限公司GMP車間生產。

1.2 抗原NDV血凝抑制試驗(HI)抗原和AIV H9亞型血凝抑制試驗抗原，均由國家獸用藥品工程技術研究中心制備；IBV血凝抑制抗原購自荷蘭GD公司。

1.3 攻毒用毒株NVD PLK-N-06株和AIV(H9亞型)SZ株，均由國家獸用藥品工程技術研究中心制備、鑒定與保存。

1.4 試驗動物河南省洛陽市某肉雞養殖場14日齡AA肉雞；湖北省荊門市某蛋雞養殖場210日齡蛋雞。

1.5 肉雞安全性和有效性研究14日齡AA肉雞9700只，頸部皮下免疫三聯苗，0.3 mL/只，另設100只不免疫作對照。

1.5.1肉雞安全性研究 每日觀察并記錄雞群的精神、采食、飲水等狀況，連續觀察14 d。每日隨機抽取20 只免疫雞，觀察疫苗注射部位，記錄有無硬結、腫脹和潰爛等不良反應，連續觀察28 d。于免疫后14 d和出欄當日(免疫后35 d)，從免疫組隨機抽取10只，連同對照雞隨機抽取3只剖殺，剖檢觀察注射部位的疫苗吸收情況。

另外，為研究三聯苗對肉雞生長性能的影響，在疫苗免疫當日、免疫后14 d和出欄當日(免疫后35 d)，從免疫雞及對照雞中各隨機抽取20 只，分別稱重，記錄結果，并運用SPSS軟件對體質量進行統計分析。

1.5.2肉雞抗體測定 于疫苗免疫當日、免疫后14，21 d和出欄當日，從免疫雞及對照雞中各隨機抽取20 只，采血并分離血清，分別檢測ND、IB和AI HI抗體效價，并運用SPSS軟件對抗體值進行統計分析。

1.5.3攻毒保護試驗 于免疫后21 d，從免疫雞中各隨機抽取20 只，同時從對照雞中隨機抽取10只，等分為2個亞組，每個亞組包含免疫雞10只、對照雞5只。第1亞組通過肌肉注射途徑進行雞新城疫病毒PLK-N-06株攻毒，105.0ELD50/只，連續觀察14 d，攻毒后第5天采集泄殖腔棉拭子，接種10～11日齡SPF雞胚，進行病毒分離。第2亞組通過靜脈注射途徑進行AI(H9亞型)SZ株攻毒，107.0EID50/只，攻毒后5 d采集喉頭和泄殖腔棉拭子，每只雞2種棉拭子混合后作為1個樣品接種10～11 日齡SPF雞胚，進行病毒分離，并運用SPSS軟件對發病率、死亡率和病毒分離陽性率進行統計分析。

1.6 蛋雞安全性和有效性研究210日齡蛋雞2 000 只，腿部肌肉注射三聯苗，0.5 mL/只，另設500只不免疫作對照。

1.6.1蛋雞安全性研究 每日觀察并記錄雞群的精神、采食、飲水等狀況，連續觀察14 d。另外，每日從免疫組隨機抽取20 只，觀察疫苗注射部位，記錄有無硬結、腫脹和潰爛等不良反應，連續觀察28 d。

另外，為研究三聯苗對蛋雞產蛋性能的影響，從免疫雞及對照雞中各抽取500只，記錄免前7 d及免疫后每日的產蛋率，連續觀察至免疫后14 d。

1.6.2蛋雞抗體檢測 于疫苗免疫當日、免疫后21 d、3和6個月，從免疫雞及對照雞中各隨機抽取20 只，采血并分離血清，分別檢測NDV、IBV和H9 AIV HI 抗體效價，并運用SPSS軟件對抗體值進行統計分析。

2 結果

2.1 肉雞安全性和有效性研究

2.1.1肉雞安全性研究 免疫雞與對照雞于免疫后每日觀察至免疫后14 d，各組雞精神、采食、飲水等均未見異常。另外，每日從免疫組分別隨機抽取20 只免疫雞，觀察疫苗注射部位，連續觀察至免疫后28 d，結果顯示，各免疫雞注射部位均無硬結、腫脹和潰爛等不良反應。免疫后14 d，免疫組剖檢注射部位除均有少量未吸收的疫苗外，無硬結、膿腫和潰爛發生；至出欄當日(免疫后35 d)，免疫組注射部位剖檢，疫苗均吸收完全。

于疫苗免疫當日、免疫后14 d和出欄當日(免疫后35 d)，從免疫雞及對照雞中各隨機抽取20 只，分別稱體質量。結果詳見表1。結果顯示，各時間點免疫雞體質量與對照雞均無明顯差異。

表1 AA肉雞疫苗免疫前后不同時間點體質量統計結果

2.1.2肉雞抗體檢測 疫苗免疫當日、免疫后14，21 d和出欄當日(免疫后35日)，從免疫雞及對照雞中各隨機抽取20 只，采血并分離血清，分別檢測NDV、IBV和H9 AIV HI抗體效價。結果顯示，對照組在免疫后抗體效價逐漸降低，至出欄當日降至最低。免疫組免疫后抗體效價逐漸升高，出欄當日升至最高， NDV、IBV和H9 AIV HI抗體效價分別達到了8.8 log2,6.7 log2,9.3 log2，免疫后不同時間免疫組抗體值均顯著高于對照組。具體結果見表2、圖1。

表2 AA肉雞疫苗免疫前后不同時間測定的HI抗體效價

A.NDV HI；B.IBV HI；C.H9 AIV HI

2.1.3攻毒保護試驗 于免疫后21 d，2組免疫雞10只，連同對照雞5只分別進行NDV PLK-N-06株和AIV(H9亞型)SZ株攻毒保護試驗。結果顯示，NDV攻毒后對照組4/5發病，2/5死亡，3/3病毒分離陽性，AIV(H9亞型)攻毒后對照組病毒分離陽性率為4/5，而免疫組NDV和H9亞型AIV攻毒后均無發病、無死亡、病毒分離陽性率為0/10，表明三聯苗能為免疫雞提供NDV和AIV(H9亞型)完全攻毒保護。

表3 AA肉雞免疫后21 d攻毒保護結果

2.2 蛋雞安全性和有效性研究

2.2.1蛋雞安全性研究 各組免疫雞與對照雞于免疫后每日觀察至免疫后14 d，結果顯示，各組雞精神、采食、飲水等均未見異常；另外，每日從各免疫組分別隨機抽取20 只免疫雞，觀察疫苗注射部位，連續觀察至免疫后28 d，結果顯示，各免疫雞注射部位均無硬結、腫脹和潰爛等不良反應發生。

從免疫組及對照組中各觀察500只，記錄免前7 d及免疫后14 d的產蛋率，連續觀察至免疫后14 d。結果顯示，免疫前第7天、免疫后第7天、免疫后第14天免疫組產蛋率分別為92.3%，92.3%，92.1%，對照組產蛋率分別為92.2%，92.3%，92.2%。免疫組在免疫前后產蛋率與對照組均無明顯差異。

2.2.2蛋雞抗體檢測 于疫苗免疫當日、免疫后21 d、3和6個月，從免疫雞及對照雞中各隨機抽取20 只，采血并分離血清，分別檢測NDV、IBV和H9 AIV HI抗體效價。結果顯示，對照組抗體效價逐漸降低，免疫組免疫后21 d，NDV、IBV和H9 AIV HI抗體效價升至最高，分別為11.6 log2，8.9 log2，12.1 log2，而后逐漸下降，但在免疫后6個月仍保持在較高的水平，顯著高于對照組。具體結果詳見表4、圖2。

表4 210日齡蛋雞免疫前后不同時間HI抗體檢測結果

A.NDV HI；B.IBV HI；C.H9 AIV HI

3 討論

由于ND強毒株作為疫苗株直接使用時存在生物安全風險，可通過基因改造的方法改變毒株的毒力。反向遺傳技術被廣泛應用于基因改造中，JI等[20]通過反向遺傳技術研制出了基因Ⅶ型NDV候選疫苗株，不但能為基因Ⅶ型毒株提供完全保護，還能顯著降低機體的排毒量。本研究中所使用的新支流三聯滅活苗中雞新城疫N7a疫苗株亦是通過反向遺傳技術致弱而得，MDT和ICPI等毒力指標達到了弱毒株標準，制備的滅活苗能產生良好的保護效力。H9亞型AIV易變異，在我國有多個分支的病毒同時流行，前期研究中，我們從大量臨床分離株中篩選了1株免疫原性好、保護譜廣的毒株SZ，可作為疫苗株用于滅活疫苗的制備。

本研究使用NDV N7a株、IBV M41株、H9 AIV SZ株制備的新支流三聯滅活疫苗在肉雞和蛋雞上進行了安全性和有效性研究。安全性結果顯示，疫苗免疫肉雞和蛋雞后均無任何不良反應，肉雞出欄時疫苗吸收完全，肉雞的增重和蛋雞的產蛋與對照組均無明顯差異，疫苗安全性良好。

血清HI抗體與攻毒保護呈正相關，抗體水平直接反應出機體抵抗病原體感染的能力[21-22]。本研究中所使用的肉雞和蛋雞在前期均免疫過相關的活苗或滅活苗，故免疫三聯苗時體內均有一定水平的抗體。但三聯苗免疫后各時間點產生的抗體水平均顯著高于對照組，肉雞免疫后14 d即有明顯提升，至出欄時抗體值達到最高，NDV HI、IBV HI、H9 AIV HI分別為8.8 log2,6.7 log2,9.3 log2，而對照組持續降低，至出欄時降至最低。肉雞免疫后21 d能對NDV和H9 AIV提供完全攻毒保護，對照組未完全發病或排毒，可能是由于攻毒時體內仍有一定水平的抗體。蛋雞免疫后21 d抗體效價達到最高，NDV HI、IBV HI、H9 AIV HI分別為11.6 log2，8.9 log2，12.1 log2，至免疫后6個月仍能達到較高水平，而對照組持續降低，除免疫當日外，免疫組各抗體效價顯著高于對照組。以上結果均表明，三聯苗免疫效果好，能有效預防雞只感染。

本研究中，新支流三聯苗在肉雞和蛋雞上能產生較好的免疫效力，且安全性良好，實現了一針三防，能大大減少單苗多次免疫造成的應激，降低免疫成本，創造更多的效益。