m6A甲基轉移酶對新城疫病毒復制的影響

李金斗，丁佳欣，馮嘉軒，陳銘樺，張 頔，邵亞男，徐小洪，丁 壯

(吉林大學 動物醫學學院 人獸共患病研究教育部重點實驗室，吉林 長春 130062)

m6A修飾(N6-methyladenosine，m6A)是腺嘌呤第6位氮原子發生的甲基修飾，廣泛存在于真核生物及細菌、病毒等原核生物的多類RNA中，其中mRNA和lncRNA中含量最高，占RNA修飾的80%以上，哺乳動物轉錄組中平均每條mRNA存在3～5個m6A位點，發生在RNA的“RRACH”([G/A][G>A]m6AC[U>A>C])基序，主要分布在翻譯起始位點、終止密碼子與 3′非翻譯區(3′-untranslated region，3′-UTR)等區域[1]。調節m6A形成的細胞機制主要由甲基轉移酶、去甲基轉移酶及結合蛋白構成。甲基轉移酶由甲基轉移酶樣因子3(methyltransferase like 3，METTL3)、甲基轉移酶樣因子14(methyltransferase like 14，METTL14)和 Wilm's腫瘤1相關蛋白(Wilms tumor 1-associated protein，WTAP)組成，METTL3與METTL14可結合形成二聚體，顯示出比單獨一種甲基轉移酶更強的甲基化效率，WTAP本身不具有甲基化活性，缺乏保守的催化甲基化結構域，負責協調METTL3-METTL14異二聚體在核斑點中的定位，輔助m6A甲基化修飾的進程[2-3]。

m6A修飾不僅調節應激反應、生育力、干細胞分化、晝夜節律等多種生物學過程，在病毒感染及宿主細胞抗病毒反應中也發揮重要功能。近年研究表明m6A修飾可動態調控病毒復制，過表達甲基轉移酶METTL3和METTL14可促進人類免疫缺陷病毒(HIV)[4-5]、甲型流感病毒(IAV)[6]、卡波氏肉瘤病毒(KSHV)[6]、腸道病毒71型(EV71)[7]、猴空泡病毒 40(SV40)[8]和呼吸道合胞病毒(RSV)[9]的復制，但對乙型肝炎病毒(HBV)[10]、丙型肝炎病毒(HCV)[11]、寨卡病毒(ZIKV)[12]和水泡性口炎病毒(VSV)[13]表現出抑制效果，沉默或敲除METTL3和METTL14則表現出相反效果，這可能是由于在不同類型病毒中，m6A修飾的相關酶下游調控靶基因有所不同。除了上述病毒外，m6A修飾對其他病毒，尤其是在禽類病毒的感染或宿主細胞的抗感染過程中的調控作用并不清楚。新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是一種單股負鏈RNA病毒，是危害禽類動物及養殖業的主要病原體之一。本研究以m6A修飾甲基轉移酶METTL3/METTL14和NDV為研究對象，探索m6A修飾對NDV復制的影響，為禽類病毒的理論研究拓展新領域，同時也為研究禽類病毒藥物靶點提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、載體和毒株雞巨噬細胞(HD11)、E.coliDH5α感受態細胞由本室凍存；pEASY?-T1載體購自北京全式金生物技術有限公司；pcDNA3.1(+)載體由本室凍存；NDV NA-1株由本室凍存。

1.2 主要試劑反轉錄酶M-MLV、重組RNase抑制劑購自北京寶日醫生物技術有限公司；高保真酶HiFi、T4DNA連接酶、DNA Marker、蛋白Marker、去內毒素質粒大提試劑盒以及BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；CCK-8細胞毒性檢測試劑盒購自日本同仁公司；Eastep?Super總RNA提取試劑盒購自上海普洛麥格公司；m6A甲基轉移酶抑制劑(3-deazaadenosine hydrochloride，DAA)購自MCE公司；Opti-MEMTMⅠ減血清培養基購自Gbico公司；兔抗METTL3和兔抗METTL14抗體購自CST公司；羊抗兔IgG-HRP和羊抗小鼠IgG-HRP購自Immunoway公司。

1.3 引物設計根據NCBI公布的雞源甲基轉移酶METTL3序列(XM_025145967.1)和METTL14序列(NM_001031148.1)設計引物(表1)，引物Q-M3 F/Q-M3 FR和Q-M14 F/ Q-M14 R分別用于分析甲基轉移酶METTL3和METTL14的轉錄水平和擴增METTL3和METTL14全長基因。

表1 引物信息

1.4 NDV感染后mRNA整體甲基化水平分析將NA-1株以MOI=0.1感染HD11細胞24 h后，提取細胞總mRNA，按照EZ RNA Methylation Kit (ZYMO)操作說明書分析病毒感染后宿主mRNA甲基化總體水平，根據公式m6A%=[(樣品D值-陰性對照D值)/樣品RNA總量]/[(陽性對照D值-陰性對照D值)/陽性樣品RNA總量]×100%分析細胞mRNA甲基化水平變化。

1.5 NDV感染對METTL3及METTL14的表達水平分析將NDV NA-1株以MOI=0.1感染HD11細胞24 h，按照Eastep?Super總RNA提取試劑盒操作說明書提取細胞總RNA以及利用RIPA蛋白裂解液處理細胞提取細胞總蛋白。將RNA反轉錄后利用熒光定量PCR分析METTL3及METTL14的轉錄水平；將提取的細胞總蛋白利用BSA蛋白濃度測定試劑盒定量后，采用Western blot試驗分析METTL3及METTL14的翻譯水平。

利用激光共聚焦試驗分析METTL3及METTL14在胞內分布，具體方法：將HD11細胞按照3×105個/孔鋪板于含有細胞爬片的12孔板中，16 h 后以MOI=0.1接種NA-1株，24 h后棄掉上清，采用4%組織細胞固定液固定10 min， 0.1%Triton-X100通透15 min，5%的BSA室溫封閉1 h，分別加入1∶500 稀釋的兔抗METTL3和METTL14抗體，4℃過夜孵育，加入1∶500稀釋的熒光標記二抗室溫孵育1 h，加入DAPI染核5 min，期間利用PBS清洗3次。

1.6 抑制甲基轉移酶功能對NDV復制的影響以30 μmol/L m6A甲基化抑制劑DAA 處理HD11細胞12 h，隨后接種MOI=0.1的NDV NA-1株，24 h后棄掉培養上清，按照Eastep?Super總RNA提取試劑盒操作說明書提取細胞總RNA，利用熒光定量PCR分析NDV參與形成RNPs復合物的NP基因及毒力基因F和HN的轉錄水平。

1.7 METTL3及METTL14過表達質粒構建提取HD11細胞總RNA，反轉錄后擴增METTL3和METTL14基因，并引入FLAG標簽，分別與pcDNA3.1載體進行連接，構建pcDNA3.1-FLAG-METTL3與pcDNA3.1-FLAG-METTL14過表達質粒。將連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，利用PCR及雙酶切對其進行鑒定，按照去內毒素質粒大提試劑盒操作說明書提取鑒定正確的質粒。

1.8 過表達甲基轉移酶對NDV復制的影響按照轉染試劑說明書分別將pcDNA3.1空載體、pcDNA3.1-FLAG-METTL3與pcDNA3.1-FLAG-METTL14轉染至60%～70%密度的HD11細胞中，18 h后按照MOI=0.1接種NDV NA-1株；病毒感染后18 h提取細胞總RNA及總蛋白，利用熒光定量PCR及Western blot分析m6A甲基轉移酶對NDV的轉錄及翻譯水平。

1.9 統計學分析采用Graph-Pad 6.0 軟件對數據進行t檢驗或單因素方差統計學分析并繪制圖表。

2 結果

2.1 宿主細胞RNA整體甲基化水平檢測病毒感染后采用EZ RNA Methylation Kit (ZYMO)分析HD11細胞的RNA整體甲基化水平，結果如圖1所示，NDV感染組總RNA的m6A修飾百分比顯著高于未感染組(P<0.05)，表明NDV感染后能夠顯著增加宿主細胞總RNA的整體甲基化水平。

圖1 總RNA m6A百分比檢測

2.2 METTL3及METTL14表達水平分析熒光定量PCR結果顯示，與未感染組相比，NDV感染后顯著抑制METTL3的mRNA轉錄(P<0.001)，但上調了METTL14的mRNA轉錄(P<0.001)(圖2A)；與之相符，Western blot(圖2B)和免疫熒光(圖2C)結果顯示，NDV感染后能夠抑制METTL3的表達，而促進METTL14的表達。

A.mRNA轉錄水平分析；B，C.蛋白翻譯水平分析

2.3 抑制甲基轉移酶功能可促進NDV復制利用可消耗細胞內甲基供體S-腺苷甲硫氨酸的DAA處理進而抑制m6A甲基轉移酶的功能后，熒光定量PCR結果顯示(圖3)，NDV的NP、F及HN基因的轉錄水平顯著上調(P<0.001)。

圖3 NDV NP、F和HN基因轉錄水平檢測

2.4 METTL3及METTL14過表達質粒的構建及鑒定構建過表達質粒pcDNA3.1-FLAG-METTL3和pcDNA3.1-FLAG-METTL14，利用PCR及雙酶切對其進行鑒定，結果如圖4所示，METTL3基因大小約為1 800 bp，METTL14基因大小約為1 400 bp，pcDNA3.1空載體片段約5 400 bp，均與理論值相符。

A.pcDNA3.1-FLAG-METTL3質粒鑒定；B.pcDNA3.1-FLAG- METTL14質粒鑒定。M.Trans2K plus DNA Marker;1.PCR擴增結果；2.雙酶切鑒定結果

2.5 過表達甲基轉移酶抑制NDV復制熒光定量結果顯示，與對照組(PC+NDV)相比，過表達METTL3(PM3)與METTL14均能顯著抑制NDV NP基因的mRNA轉錄(P<0.001)(圖5A)；Western blot結果顯示兩者均能顯著抑制NP蛋白的翻譯(圖5B)，其中過表達METTL14的抑制作用更為顯著。

A.NP基因mRNA轉錄水平分析；B.NP基因翻譯水平分析

3 討論

與DNA和組蛋白相似，RNA也經歷動態和可逆的化學修飾，以調控基因的表達。在真核生物及細菌、病毒等原核生物的多類RNA中已經發現了數百種不同的化學基團，可在RNA 的4個核苷酸的1個或多處進行修飾，其中以m6A修飾最為普遍。已有研究表明m6A對mRNA的穩定性有重要調節作用，進一步影響mRNA的翻譯、出核以及與蛋白質的相互作用。20世紀80年代前就已經在勞斯氏肉瘤病毒[14]和猴空泡病毒40[15]等病毒的RNA中發現了m6A修飾，直至2012年，由于轉錄組甲基化RNA 免疫沉淀(MeRIP)與N6-甲基腺苷測序(m6A-seq)技術的開發[16-17]，研究者才開始探索 m6A 修飾在病毒致病機理中的作用，但仍對病毒感染和致病機理的調控知之甚少。NDV感染后增強了RNA的總體甲基化水平，宿主細胞或可通過m6A甲基機制抑制病毒復制，病毒也可能劫持該機制逃避免疫系統的監視。已有研究表明含有m6A修飾的RNA與RIG-I的結合能力較弱，不能觸發經典的RIG-I通路[18]。m6A甲基化修飾的RNA只能誘導DC細胞產生少量的細胞因子，刺激表達TLRs的細胞時也只能引起少量免疫激活標志物的釋放，無法誘導較強的先天免疫反應[19]。與未修飾的外源性circRNA抗原佐劑相比，m6A修飾的circRNAs抑制了免疫基因活化和佐劑活性，誘導抗原特異性T細胞活化、抗體產生和體內抗腫瘤免疫的能力減弱[20]。

m6A甲基轉移酶METTL3和METTL14能以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM) 為甲基化供體，催化RNA的m6A形成[2,21]。NDV感染后，宿主細胞METTL3和METTL14轉錄及表達水平均有變化，這或許也是導致病毒感染后RNA整體甲基化水平發生變化的原因。m6A修飾主要通過相關酶調控宿主及病毒基因轉錄后修飾，進而影響病毒的復制及感染。已有研究顯示METTL3和METTL14對HIV-1[4-5]、IAV[6]和RSV[9]等病毒的感染過程起正調控作用，卻充當ZIKV[12]、HCV[11]等病毒的轉錄后負調控因子，導致這種不同作用效果的原因暫不清楚，推測與病毒的復制場所或病毒毒力基因的靶分子不同有關。本研究利用DAA消耗細胞內甲基供體SAM抑制m6A的甲基轉移酶功能，顯著促進NDV NP基因的轉錄，而過表達METTL3和METTL14抑制了NDV NP基因的轉錄及翻譯，表明甲基轉移酶在NDV的復制過程中起負調控作用，這與在細胞質中復制的病毒如ZIKV、HCV等的結果相似。其中METTL14較METTL3具有更強的抑制NDV復制的作用，可能與METTL14蛋白更高的甲基化活性有關[2]。但m6A甲基轉移酶如何介導NDV復制的具體機制還有待進一步研究。綜上，本研究發現NDV感染后，增加了RNA的總體甲基化水平，這或與甲基轉移酶的表達量發生變化有關，并進一步證明m6A甲基轉移酶對NDV的復制起負調控作用，為了解m6A修飾在不同病毒中的生物學功能具有重要意義，也拓展了m6A修飾對禽類病毒研究領域科學前沿，為禽類病毒與宿主研究提供新思路。