廣西PRRSV分離株Y12018全基因組擴增和遺傳進化分析

王 政，解長占，于成東，于 桐 ，李亭玉，李金鳳，孟 媛 ，魯會軍，金寧一，張雪梅

(1.延邊大學 農學院，吉林 延吉 133002；2.軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所，吉林 長春 130122；3.吉林農業大學 動物科學技術學院，吉林 長春 130118；4.吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

豬繁殖與呼吸系統綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種以受孕母豬繁殖障礙和仔豬呼吸綜合征為主要特征的高度接觸性傳染病。不同性別、年齡階段和品種的豬均可被感染，感染妊娠母豬出現流產、死胎、弱胎和木乃伊胎等情況，流產率達30%，1月齡以內的仔豬相對較易被感染，感染仔豬伴有呼吸困難、發育遲緩和敗血癥等現象[1-2]。自1987年首次報道以來，全球除僅有少數國家如新西蘭、瑞士及澳大利亞無疫情報道外，在其他地區和國家仍然呈地方流行性趨勢[3]。我國PRRSV流行至今大致分為以下3個階段：美洲型經典PRRSV流行期；高致病性PRRSV流行期；多種PRRSV流行的穩定控制期。當前PRRS依然給我國及世界的養豬業帶來巨大的經濟損失，對養豬業的影響和危害依然存在。

在1996年國際病毒分類委員會的報告中，將PRRSV歸屬至動脈炎病毒科(Arteriviridae)，動脈炎病毒屬(Arterivirus)，該屬病毒共同存在的特點即發生變異和重組的頻率較高，并且具有巨噬細胞內復制的能力，能夠誘發自然宿主持續性感染[4]。PRRSV為不分節段的單股正鏈RNA病毒，全長約15 kb，其開放性閱讀框(ORF)依次命名為ORF1a(ORF1a-TF)-ORF1b-ORF2a-ORF2b-ORF3-OR-F4-ORF5a-ORF5a-ORF6-ORF7，5′端有帽子結構，3′端有UTR和Poly(A)尾巴。其中ORF1a和ORF1b主要編碼與病毒復制和轉錄相關的酶，ORF2～5 分別編碼 GP2、GP3、GP4、GP5 蛋白，ORF6編碼N端非糖基化的膜蛋白M，ORF7編碼病毒核衣殼蛋白N[5-7]。RNA病毒基因組因存在點突變、缺失和插入等變異方式具有很高的突變頻率，PRRSV的各不同分離株間的核苷酸序列存在廣泛變異且不同基因類型的變異速率各不相同，變異速率達每年10-2/位點，高于一般RNA病毒的每年突變速率(10-3～10-5/位點)[8]。

2001年美國出現的PRRSV變異株MN184A、MN184B和MN184基因組均存在 Nsp2氨基酸的131個不連續缺失，對應經典毒株基因組位置分別為324～434，486和505～523，美國國家動物疾病中心(NADC)于2008年首次分離具有相同缺失模式的毒株并將其命名為NADC30[9-11]。我國關于NADC30的相關報道較少，自2012年起我國陸續出現與美國NADC30毒株遺傳進化關系較為相近的毒株，并將其統一命名為類NADC30毒株(NADC30-like)。我國NADC30-like毒株的出現很可能是由美國輸入的NADC30毒株與我國境內的主要流行毒株(VR-2332、HP-PRRSV和疫苗毒株等)發生重組并經過進化演變而來。流行病學調查顯示，自2014年起，北京、天津、河北、吉林、黑龍江、廣西、江蘇、浙江、四川和福建等我國大部分地區的類NADC30毒株臨床檢出率相對較高且呈上升趨勢，疫情已涉及我國大部分省市，NADC30-like很可能已經成為我國境內的主要流行毒株。NADC30-like毒株的出現增加了PRRSV防治難度和臨床癥狀的復雜性，對于該類毒株的監測和全基因組特征分析對流行預警和疾病防控具有重要戰略意義。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株及細胞從廣西壯族自治區某發病豬場分離疑似PRRS陽性樣品；Trans1-T1感受態和Marc-145細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑Random Primer(9mer)、dNTP Mixture、DL2000核酸Marker等購自TaKaRa公司；TransStart Fastpfu Fly DNA Polymerase、5×TransStart Fastpfu Fly Buffer等購自全式金公司；pClone 007 Blunt Vector購自TSINKE公司；M-MLV RT 5×Buffer、M-MLV Reverse transcriptase等均購自 Promega公司;UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒購自生工生物工程股份有限公司；膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自Invitriogen公司。

1.3 引物合成根據GenBank數據庫提供的PRRSV NADC30-like毒株的核苷酸序列，設計10對擴增PRRSV全長所需的引物(表1)，并將引物送由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

表1 類NADC30毒株全基因組擴增引物序列

1.4 病毒總RNA的提取和反轉錄將PRRSV分離株接種于Marc-145細胞中，37℃吸附1 h，后棄去上清，加入DMEM(含2% FBS)后繼續培養，出現明顯CPE(達75%以上)后收集細胞培養物，反復凍融3次后，利用總RNA提取試劑盒按說明書提取病毒基因組RNA后常規方式反轉錄為cDNA，將其置于-20℃儲存備用。

1.5 目的基因分段擴增將得到的cDNA作為模板，使用引物進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL):cDNA模板1 μL；上、下游引物各1 μL；Fly酶0.5 μL；5×Fly Buffer 5 μL；dNTP 2.5 μL；ddH2O 14 μL。PCR儀擴增程序：95℃預變性2 min；95℃變性20 s；退火20 s(溫度均采取相對應引物的最適退火溫度)；72℃延伸90 s；40個循環結束后再72℃延伸10 min。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 擴增產物的克隆及測序將大小正確的瓊脂糖凝膠電泳產物利用試劑盒進行膠回收，具體操作步驟詳見說明書，目的條帶與pClone 007 Blunt Vector連接后將連接產物轉化到大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞中，然后篩選重組陽性質粒，接種于含有Amp+的LB液體培養基中，37℃震蕩培養約12 h，最后小提回收重組質粒送至庫美生物科技有限公司進行序列測定。

1.7 全基因序列拼接及分析利用DNAMAN 6.0將分段獲得并成功測序的核苷酸序列進行拼接，然后將其進行校正后得到完整的全基因序列，然后采用DNAStar 7.1和MEGA 5.2等軟件將全基因序列與GenBank數據庫中下載的具有代表性的10株參考毒株的核苷酸序列及相對應編碼氨基酸的序列進行同源性比對和分析，并用MEGA 7.0軟件構建進化樹。參考毒株相關信息詳見表2。

表2 參考毒株

2 結果

2.1 PRRSV Y12018株全基因擴增結果利用UNIQ-1-柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取疑似樣品的總RNA，并轉錄為cDNA，用10對引物進行PCR擴增，擴增出病毒基因組的各目的片段與預期一致(圖1)，將測序結果利用DNA Star 7.1 SeqMan 拼接為Y12018全基因組序列，拼接校對后的基因組全長為15 017 bp(除去polyA尾)，包括長度為191 bp的5′UTR和145 bp 的3′UTR。

M.DL5000 DNA Marker;1～10.PRRSV-1F、PRRSV-2F、PRRSV-3F、PRRSV-4F、PRRSV-5F、PRRSV-6F、PRRSV-7F、PRRSV-8F、PRRSV-9F、PRRSV-10F

2.2 全基因組遺傳進化分析及同源性對比利用MEGA 5.2和DNA Star 7.1將Y12018全基因組序列與GenBank上收錄的國內外10株參考毒株基因組序列構建遺傳進化樹并進行核苷酸同源性分析(圖2)。結果表明，PRRSV毒株分為2個基因型，以Lelystad virus (LV)為代表的歐洲型分支，美洲型毒株又可分為4個分支，以VR-2332和RespPRRS-MLV為代表的分支，以我國分離的CH-1a為代表的分支，以JXA1、HUN4和FJXS15為代表的HP-PRRSV-like分支，以NADC30和NADC34為代表的分支。遺傳進化樹結果顯示Y12018與NADC30的遺傳關系最為接近。Y12018分離株與 Lelystad virus (LV) 同源性最低為58.5%，與美國分離的NADC30毒株的同源性最高為94.4%，與美洲型VR-2332毒株同源性為82.5%。

圖2 基于Y12018 全基因核苷酸序列的遺傳進化分析

2.3 GP5基因進化樹分析及同源性對比利用MEGA5.2構建進化樹，系統進化樹顯示Y12018分離株與NADC30、NADC34和FJXS15屬于同一分支，與NADC30親緣關系最近(圖3)。利用DNAStar 7.1軟件中的MegAlign將分離株Y12018的GP5基因核苷酸序列與參考序列對比，結果顯示Y12018分離株與Lelystad virus (LV) 同源性為59.5%，與NADC30、FJXS15和NADC34的同源性分別為92.9%，92.4%和85.8%，對比NADC30氨基酸序列參在31個位點的改變。

圖3 基于Y12018 GP5基因核苷酸序列的遺傳進化分析

2.4 Nsp2基因進化樹分析及同源性對比利用MEGA 5.2構建進化樹,系統進化樹顯示分離株Y12018與NADC30和NADC34屬于同一分支，與NADC30親緣關系最接近。利用DNAStar 7.1軟件中的MegAlign將分離株Y12018的Nsp2基因的核苷酸序列與參考序列對比，結果顯示Y12018分離株與Lelystad virus (LV) 同源性為50.0%，與NADC30和NADC34的同源性分別為93.5%和79.7%。Nsp2氨基酸序列對比結果顯示：分離株Y12018的Nsp2基因對應氨基酸存在“111+1+19”的缺失模式，即分別對應VR-2332分別為第324～434、486和505～523位置，缺失情況與NADC30一致，表明分離株Y12018屬于NADC30-like亞群(圖4A～D)；同時與參考序列NADC30對比得出分離株Y12018的Nsp2氨基酸序列存在2個氨基酸位點的缺失，對應VR-2332的位置為617與618。(圖4E)。

圖4 Nsp2基因的氨基酸序列比對分析(缺失部分用方框標出)

2.5 主要開放閱讀框核苷酸同源性對比利用DNAStar 7.1軟件中的MegAlign將分離株Y12018的各開放閱讀框(5′UTR、ORF1a、1b、2～7和3′UTR)的核苷酸序列與GenBank數據庫中收錄的10株參考序列進行對比，各開放閱讀框核苷酸同源性的對比結果見表3。

表3 Y12018與10株參考毒株不同開放閱讀框核苷酸同源性的比較 %

3 討論

自PRRSV在世界上首次被報道至今已30余年，PRRSV毒株不斷發生進化具有多樣性，無疑加大了該病的防治難度，給我國養豬業帶來了巨大的經濟損失。目前的田間流行毒株主要包括PRRSV野毒株、重組毒株、疫苗毒株和HP-PRRSV毒株等[12]，類NADC30毒株的出現又成為新的流行毒株且具有易和其他毒株發生重組的特點，使得NADC30-like毒株在我國的流行呈現加劇趨勢[1,13-14]。

GP5作為PRRSV重要的糖基化膜蛋白，大小為130～200aa，具有較大的C端結構域，存在6個B淋巴細胞表位和3個T淋巴細胞表位，可誘導中和性抗體的產生且其中和活性優于其他的結構蛋白所產生的中和性抗體[15-16]。該分離株Y12018與NADC30的GP5同源性為92.9%，氨基酸序列對比結果發現分離株Y12018存在31個位點的改變。Nsp2基因位于ORF1區域編碼病毒主要的非結構蛋白，具有較好的免疫原性同時也存在高度變異等特點，可通過該區段的變異從而分析PRRSV的變異情況[17]。本研究中分離株Y12018與NADC30的Nsp2同源性為93.5%，氨基酸序列大部分缺失情況與NADC30一致，同時與NADC30相比缺失的2個氨基酸對應VR-2332為587～588位點。相關研究結果表明非結構蛋白Nsp2氨基酸的缺失可能與病毒毒力之間密切相關，因此基因差異與致病力之間存在的關系還有待進一步研究。

通過對分離株Y12018的全基因進行擴增，并將全基因組、GP5和Nsp2等基因核苷酸序列與參考毒株同源性對比分析，結果表明該分離株為NADC30-like毒株。本研究可為進一步探究廣西地區PRRSV的遺傳和進化關系提供理論依據，并為后續致病性研究奠定基礎。