豬血凝性腦脊髓炎病毒感染對小鼠腦內星形膠質細胞的影響

徐榮藝，石俊超，張 競，高 蕊，李 姿，賀文琦，高 豐

(吉林大學 動物醫學學院，吉林 長春 130062)

豬血凝性腦脊髓炎是由豬血凝性腦脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus，PHEV)感染所致的一種急性、高度傳染性疾病。PHEV為冠狀病毒科、β冠狀病毒屬成員，主要侵害3周齡以內的仔豬，臨床以仔豬嘔吐和神經癥狀為典型特征，死亡率可達100%[1]。現已發現有些PHEV毒株可感染成年豬，呈呼吸道感染為主的急性流感樣癥狀[2]。PHEV具有典型的噬神經特性，主要侵害宿主的中樞神經系統，引發非化膿性腦脊髓炎[3]。由病毒引起的腦脊髓炎是導致宿主發病死亡的重要原因[4]，然而目前仍缺乏有效的疫苗及特異性的藥物。因此對于PHEV致病機制的研究尤為迫切且意義重大。星形膠質細胞是中樞神經系統(central nervous system,CNS)中含量最多的一類細胞，擔負著神經遞質的轉運與再循環、離子穩態、能量代謝、感染防御以及維持血腦屏障完整性等眾多功能[5]。已有研究報道某些噬神經病毒例如水泡性口炎病毒(VSV)、單純皰疹病毒(HSV)等感染過程中，星形膠質細胞發生活化[6-8]。然而，PHEV感染后是否會引起星形膠質細胞活化以及活化的星形膠質細胞所發揮的作用還未見有相關的報道。本研究表明，PHEV感染過程中小鼠腦內星形膠質細胞發生大量活化，有趣的是PHEV并不能感染星形膠質細胞，表明星形膠質細胞的活化并非病毒直接感染引起。后續試驗將從星形膠質細胞活化的機制及活化的星形膠質細胞在病毒感染過程中發揮的作用方面展開研究，研究結果可為進一步闡明PHEV的致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒及來源豬血凝性腦脊髓炎病毒株PHEV-CC14(GenBank登錄號：MF083115)從自然感染發病仔豬腦組織勻漿分離獲得，并由本實驗室保存。

1.3 實驗動物3周齡雌性BALB/c小鼠，購自遼寧長生實驗動物有限公司。小鼠自由采食飲水，試驗組小鼠通過滴鼻接種0.03 mL PHEV病毒液(TCID50為10-4.2/0.1 mL)，對照組小鼠通過滴鼻途徑接種同樣劑量的PBS (0.01 mol/L,pH 7.4)。分別于接毒后1～5 d相應時間點處死小鼠，冰上取出腦組織進行后續qRT-PCR、Western blot檢測及石蠟切片制作。

1.4 RT-PCR及熒光定量PCR取采集的小鼠腦組織，根據TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒說明書提取總RNA，測定濃度后將其反轉錄為cDNA。查找GenBank中GFAP和GAPDH基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計相應的引物(表1)，將引物序列發送至庫美生物合成。使用rTaq酶進行常規PCR后凝膠電泳觀察條帶大小及特異性，使用QuantStudioTM3 Real-Time PCR System進行熒光定量PCR反應。反應體系如下：2×SYBR Green Master Mix (10 μL)、cDNA模板 (2 μL) 、上游引物(1 μL)、下游引物(1 μL)、蒸餾水補充至 20 μL。所得數據由QuantStudioTMDesign and Analysis Software version 1.4.3軟件分析，內參基因選擇GAPDH。

表1 qRT-PCR反應引物信息

1.5 Western blot檢測取采集的小鼠腦組織于離心管中加入適量RAPI裂解液(含PMSF)，用眼科剪將組織剪碎并用勻漿器進行勻漿，冰上裂解30 min 以充分裂解蛋白。用BCA法測定濃度，將樣品蛋白濃度調整一致后加入上樣緩沖液，于微波爐上開水煮沸10 min，12 000 r/min離心10 min。取樣品加入到蛋白膠加樣孔中，上層膠80 V，30 min，下層膠120 V，90 min進行電泳分離。電泳結束后，300 mA恒流濕式轉膜1 h；將蛋白轉移到PVDF膜上,37℃、5% BSA封閉1 h；加GFAP抗體和GAPDH抗體4℃孵育過夜；PBST洗滌充分后，用HRP標記的二抗室溫孵育1 h；PBST洗滌后ECL顯影并采集圖像，使用Image J對條帶灰度值進行分析。

1.6 石蠟切片制作矢狀切取小鼠半腦后置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h以上，酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，石蠟切片機切片。

1.7 間接免疫熒光將上述切片置于二甲苯和梯度酒精中脫蠟復水，并將切片放入適量檸檬酸鈉(pH 6.0)溶液進行抗原修復，37℃、5% 脫脂奶粉封閉1 h；加入稀釋好的一抗4℃孵育過夜；PBST溶液清洗后加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h；PBST溶液清洗切片，加入稀釋好的DAPI溶液染核；清洗干凈后滴加封片劑封片，用熒光顯微鏡觀察，根據不同的染料選擇不同波段的激發光，采集圖像。

2 結果

2.1 qRT-PCR檢測小鼠腦組織中GFAP基因表達情況

2.1.1RT-PCR擴增結果 使用合成的GAPDH和GFAP引物進行常規PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示為單一條帶，大小符合預期(圖1)，表明引物特異性好，可用于下一步試驗。

M.DL2000 DNA Marker;C.對照組;1～5.接種PHEV后1～5 d

2.1.2qRT-PCR檢測結果 對照組與試驗組小鼠腦組織均可檢測到GFAP基因轉錄。與對照組小鼠相比，接毒3 d后小鼠腦組織GFAP基因轉錄水平顯著升高并且隨著感染時間延長差異更加顯著(圖2)。

C.對照組;1～5.接種PHEV后1～5 d

2.2 Western blot檢測小鼠腦組織GFAP蛋白表達對照組與試驗組小鼠腦組織均可檢測到GFAP蛋白表達，且其表達量隨著感染時間的延長呈現上升趨勢，蛋白條帶大小約為50 kDa，與預期相符(圖3)；經統計分析，與對照組相比，試驗組小鼠于接毒后3 d即差異顯著(圖4)。

C.對照組;1～5.接種PHEV后1～5 d

C.對照組;1～5.接種PHEV后1～5 d

2.3 間接免疫熒光結果免疫熒光結果顯示(圖5)，對照組小鼠腦組織病毒染色陰性，GFAP標記的星形膠質細胞胞體較小，數量少，零散分布；接毒5 d后，試驗組小鼠腦組織含有大量病毒分布，GFAP標記的星形膠質細胞數量增加，分布集中且胞體變大，突起更加明顯；PHEV與GFAP不發生共定位，說明PHEV不能直接感染星形膠質細胞。

Control.對照組;PHEV-D5.接種PHEV后5 d小鼠;DAPI.細胞核

3 討論

多數噬神經病毒感染腦組織后能夠引發神經炎癥，然而神經炎癥在病毒性腦脊髓炎中的作用還有待進一步研究。最初的神經炎癥反應可能有利于病毒的清除，但是中樞神經系統長期暴露在促炎細胞因子/趨化因子的環境中可能會導致神經死亡及組織損傷。星形膠質細胞的活化是神經炎癥過程中的一個重要特征，明確神經炎癥反應及星形膠質細胞在病毒性腦炎過程中發揮的作用有利于更好地理解其發病機理并據此開發新的治療方法。

PHEV屬于典型的噬神經性病毒，病毒經外周神經末梢感染并沿神經向體內傳遞后，局限于CNS中大腦、脊髓、延髓及腦干的神經元胞質及突起，引起神經損傷，并且在整個感染過程中檢測不到病毒血癥，與狂犬病病毒的侵襲途徑有一定的相似性[9]。利用基因芯片檢測PHEV感染誘導小鼠大腦皮質差異表達基因的結果顯示，從病毒感染的第3天開始與星形膠質細胞活化相關的因子，如GFAP、Vim、CCL5、CXCL10，發生顯著升高，這提示我們PHEV感染可能激活宿主CNS中的星形膠質細胞[10]。星形膠質細胞活化的標志為GFAP表達升高，同時胞體肥大、細胞增生[11]。活化的星型膠質細胞作為神經炎癥的重要調節者，能夠釋放廣泛的免疫介質，例如細胞因子、趨化因子及生長因子，這些因子既能發揮神經保護作用也可能發揮神經毒性作用。例如星形膠質細胞通過負反饋調節抑制小膠質細胞過度活化控制炎癥反應從而發揮神經保護作用[12]。與上述相反，在脊髓損傷模型中，活化的星形膠質細胞是有害的，選擇性的抑制星形膠質細胞有利于損傷的修復[13]。上述結果表明，在不同的病理條件下，星形膠質細胞可能發揮截然不同的作用。

星形膠質細胞及小膠質細胞作為CNS主要的細胞類型，廣泛參與到腦組織穩態的維持及各種功能的發揮。小膠質細胞起源于髓系細胞，被認為是CNS中專職的巨噬細胞，其能夠表達多種模式識別受體，因此，以往關于CNS先天免疫的研究多集中于小膠質細胞[12,14]。然而，近期的研究證實星形膠質細胞在CNS先天免疫中的功能也不容忽視。星形膠質細胞起源于神經外胚層，是CNS中數量最多的膠質細胞類型，其在腦血管周圍形成膠質界膜限制免疫細胞進入到腦實質[15]。同時，星形膠質細胞表達一系列與天然免疫有關的受體，包括Toll樣受體、NOD樣受體、清道夫受體、甘露糖受體及補體系統的成分[12]。本課題組前期研究證實，PHEV感染可激活小鼠腦內的小膠質細胞[16]，活化的小膠質細胞發揮的免疫功能及其內在機制是目前研究的重點。

本研究以星形膠質細胞特異性標記物GFAP為檢測對象，評價PHEV感染后星形膠質細胞的活化狀態。結果表明，與對照組小鼠相比，試驗組小鼠接種PHEV后腦組織GFAP基因轉錄水平及蛋白表達水平都發生了顯著升高，且隨著感染時間的延長而逐漸增加，直至感染后第5天小鼠死亡時達到峰值。表明PHEV感染后，CNS中活化的星形膠質細胞不斷增殖，伴隨整個感染過程。間接免疫熒光結果進一步表明感染 PHEV后的小鼠腦組織星形膠質細胞數量明顯增多，呈聚集樣分布，同時胞體增大，突起變多。以上結果分別從基因轉錄水平、蛋白表達水平和組織學分布及形態等3個方面證實PHEV感染后小鼠腦內星型膠質細胞發生了明顯增殖、活化現象。

前期大量研究結果均表明，神經元為PHEV感染的靶細胞，星形膠質細胞不能被PHEV感染，這提示我們星形膠質細胞的活化并非是由PHEV直接感染所引起。我們推測，PHEV感染的神經元可能產生了某種物質從而介導星形膠質細胞的活化。根據文獻報道，IL-1、TNF-α、IFN-γ等多種細胞因子均可激活星形膠質細胞[12]，例如在呼腸孤病毒性腦炎小鼠模型中，星形膠質細胞是由呼腸孤病毒感染神經元產生的IFN-β激活[11]。然而在PHEV感染的小鼠腦脊髓炎模型中星形膠質細胞活化的確切機制及活化的星形膠質細胞發揮的作用仍需進一步試驗研究。

綜上所述，本研究明確了PHEV感染后可使小鼠CNS中星形膠質細胞發生活化、增殖，并且該過程伴隨著整個感染進程。該結果可為后期深入開展PHEV所致神經系統炎性損傷的機制研究奠定一定的基礎。