表達豬圓環病毒2型Cap蛋白重組耐熱新城疫病毒的構建及免疫原性

李 麗，趙 康，張 媛，王紅琳，羅青平，邵華斌,2，潘茲書，溫國元,2*

(1.湖北省農業科學院 畜牧獸醫研究所，湖北 武漢 430064；2.農業部畜禽細菌病防治制劑創制重點實驗室，湖北 武漢 430064；3.武漢大學 生命科學學院，湖北 武漢 430074)

豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)屬于圓環病毒科，為單股負鏈閉合環狀DNA病毒，是目前所發現最小的動物病毒[1]。PCV2是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的重要病原[2-4]，發生PMWS疾病的豬群死亡率達5%～30%[5]。PCV2的感染會導致豬群免疫力下降，造成嚴重的免疫抑制。其和細小病毒、豬肺炎支原體、豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒等病原共同感染使豬群產生圓環病毒相關疾病[6-8]，給全球養豬業造成了巨大的經濟損失[ 2,9-10]。PCV2在PK-15細胞上增殖滴度較低，且不引起細胞病變，給常規滅活疫苗的研發與生產帶來很大的困難[11]，因此，PCV2基因工程疫苗的研發是當前研究的熱點之一。

PCV2基因組全長約1.7 kb，有2個主要的功能性開放閱讀框(opening reading frame,ORF)。ORF1編碼2個滾環復制相關蛋白(Rep和Rep′)[12]，ORF2編碼大小約為28 kDa的PCV2 衣殼蛋白Cap[13]。研究表明Cap蛋白是PCV2的主要免疫原蛋白，包含高度保守的抗原表位，能刺激機體產生PCV2特異性中和抗體[7-8]。Cap蛋白是用于研發PCV2基因工程疫苗的首選蛋白[14]。

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)屬于副黏病毒科腮腺炎病毒屬，為單股負鏈RNA病毒。隨著反向遺傳操作系統的發展，重組NDV已成為一類研究深入且應用前景廣闊的基因工程載體疫苗。目前已經有多種病毒的保護性抗原基因在NDV中得到高效表達[15-17]。在哺乳動物體內存在的免疫力和母源抗體不會影響NDV的復制，NDV在許多動物模型中具有較高的安全性[18]。由于常規低毒力活疫苗熱穩定性差，在使用過程中冷凍保藏活疫苗的成本投入較高，且常常因為保存不當影響疫苗使用效果。以V4、HB92、TS09-C等為代表的NDV毒株具有獨特的耐熱特性，以其制備的耐熱活疫苗應用前景廣闊[19]。本研究以NDV TS09-C耐熱株為載體，構建了表達PCV2 Cap 蛋白的重組病毒，并對其生物學特性和免疫原性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞及實驗動物PCV2 HBZX株、NDV-全長克隆質粒pTS09-C、輔助質粒pVAX-NP、pVAX-P和pVAX-L、表達T7 RNA聚合酶的重組痘病毒vTF7-3、BHK-21細胞及豬圓環病毒陽性血清(兔源)由湖北省農科院畜牧獸醫研究所保存；雞源NDV陽性血清購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所；9～11日齡SPF雞胚購自北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.2 主要試劑PfuUltra Ⅱ Fusion HS DNA Polymerase購自Agilent公司；In-fusion Clone Kit購自Clontech公司；TPCK-胰酶購自Sigma公司；血清辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG、FITC標記的羊抗雞IgG抗體和FITC標記的羊抗兔IgG抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒、DAB顯色試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；PCV2滅活疫苗和ELISA抗體檢測試劑盒均購自武漢科前生物股份有限公司。

1.3 重組質粒的構建提取PCV2 HBZX株的基因組DNA，PCR擴增(Cap-F，Cap-R)刪除核定位信號(nuclear localization signal,NLS)序列的基因片段Cap/N。通過引物自延伸的方法擴增(TPA-F，TPA-R)組織纖溶酶原激活物信號肽序列(the tissue plasminogen activator signal peptide，tPAs)，將Cap/N和tPAs基因產物進行重疊延伸PCR，得到基因序列tPAs-Cap/N。為了將tPAs-Cap/N以單獨編碼框的方式插入rTS09-C載體中，通過PCR擴增(TS-Cap-F，TPA-R)將TS09-C的基因終止序列(GE)和基因起始(GS)序列分別添加到tPAs-Cap/N序列的兩端。以質粒pTS09-C為PCR模板，PCR擴增(TS-F，TS-R)出載體大片段，通過In-fusion酶同源重組將包含有GE和GS序列的tPAs-Cap/N片段和載體大片段相連接[20]。連接產物轉化DH5α感受態細胞，挑取單菌落進行酶切鑒定及測序分析，重組質粒命名為pTS-tPAs-Cap/N(用于質粒構建的引物序列見表1)。

表1 用于構建重組質粒pTS-tPAs-Cap/N的引物序列

1.4 病毒的拯救采用脂質體轉染法，將重組質粒pTS-tPAs-Cap/N和3個輔助質粒按照5.00，2.50，1.25，1.25 μg的比例共轉染至已感染vTF7-3的BHK-21細胞[19,21]。轉染后6 h，PBS洗滌細胞2次，加入含有1%雙抗和0.2 mg/L TPCK-胰酶的DMEM-培養基。37℃培養3 d后，收獲細胞培養物，反復凍融3次，將其按照100 μL/枚的劑量接種SPF雞胚。37℃孵育5 d后，收取尿囊液，測定其血凝(hemagglutinin，HA)效價[22]，對HA陽性樣品進行RT-PCR檢測及測序鑒定。鑒定正確的病毒尿囊液經過0.22 μm孔徑濾器過濾2次以除去痘病毒，在SPF雞胚上傳3代后，分裝保存于-80℃。

1.5 Western blot檢測重組NDV以0.1個感染復數(MOI)的劑量接種BHK-21細胞，37℃培養至少量細胞出現輕微病變時，用細胞刮收集細胞，進行SDS-PAGE，電轉至硝酸纖維素濾膜，3% BSA封閉過夜，以兔抗PCV2血清為一抗，HRP標記羊抗兔抗體為二抗先后進行孵育，最后以DAB顯色，觀察目的條帶。

1.6 間接免疫熒光染色重組NDV以0.1 MOI的劑量接種BHK-21細胞，37℃培養至少量細胞出現輕微病變時，用PBS洗滌3次，以預冷的固定液(丙酮∶甲醇=1∶1)于-20℃固定細胞30 min。棄去固定液，用3% BSA封閉細胞1 h。封閉結束后先后以雞抗NDV陽性血清和兔抗PCV2血清為一抗，以FITC標記的羊抗雞抗體和PE標記的羊抗兔IgG抗體為二抗，最后以DAPI進行細胞核染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照分析。

1.7 重組病毒的生長曲線測定將重組病毒進行10倍梯度稀釋，感染培養于96孔板的單層BHK-21細胞(100 μL/孔)，記錄細胞病變情況，按照Reed-Muench公式計算病毒的TCID50。將重組病毒以0.1 MOI 感染BHK-21細胞，分別于感染后24，48，72，96 h收集細胞培養上清液，測定其TCID50值，繪制重組病毒的生長動力學曲線。

1.8 病毒的耐熱特性將重組NDV尿囊液分裝于EP管中，100 μL/管，置于56℃進行熱處理，分別在5，15，30，60，90，120 min時間段取出尿囊液，迅速置于冰上。將熱處理后的重組病毒分別接種SPF雞胚3枚，37℃孵育5 d，收獲尿囊液測定其HA效價。若雞胚尿囊液HA效價≥24，判定NDV具有雞胚感染性，反之則無雞胚感染性。

1.9 致病性分析將重組NDV做10倍梯度稀釋，分別接種SPF雞胚4枚，棄去24 h內死亡的雞胚，記錄雞胚的死亡時間，計算重組病毒的雞胚最小致死量的平均死亡時間(MDT/MLD)。

2.0 重組病毒的免疫原性測定選取5周齡健康雌性BALB/c小鼠20只，分為4組即A、B、C、D組，每組5只。A組5只小鼠通過腹腔注射的方式免疫rTS-tPAs-Cap/N，注射劑量0.2 mL/只(107.0EID50/mL)；B組5只小鼠通過肌肉注射的方式免疫rTS-tPAs-Cap/N，劑量同于A組；C組5只小鼠通過肌肉注射方式免疫PCV2滅活疫苗，劑量為0.2 mL/頭份；D組為未免疫組。首免2周后，對每組小鼠斷尾取血，并分離血清。同時對4組小鼠進行第2次免疫，途徑和接種劑量不變。二免后2周，斷尾采集各組小鼠的血液，分離血清。使用PCV2 ELISA抗體檢測試劑盒檢測血清抗體，在酶標儀讀取D450 nm的吸光值，參考試劑盒說明判定被檢樣品的抗體水平。

2 結果

2.1 重組全長質粒的構建與鑒定通過設計特異性引物分別擴增tPAs和Cap/N基因(刪除Cap基因的NLS序列，即N端的123個堿基)，將2個基因片段經過重疊延伸PCR擴增得到tPAs-Cap/N片段。將tPAs-Cap/N克隆于全長質粒pTS09-C中，獲得重組全長質粒pTS-tPAs-Cap/N(圖1)。對重組質粒進行XbaⅠ酶切鑒定，結果如圖2。將鑒定正確的重組質粒進行全長序列測定，測序結果完全正確，表明重組全長質粒pTS-tPAs-Cap/N構建成功。

圖1 重組NDV rTS-tPAs-Cap/N的基因組結構示意圖

M.DL15000 DNA Marker；1.對照質粒pTS09-C的XbaⅠ酶切鑒定；2.重組質粒pTS- tPAs-Cap/N的XbaⅠ 酶切鑒定

2.2 重組病毒的拯救通過脂質體法將重組全長質粒pTS-tPAs-Cap/N和3個輔助質粒共轉染預感染vTF7-3的BHK-21細胞，待細胞出現病變后，收獲細胞液，反復凍融3次，接種SPF雞胚。對收獲的雞胚尿囊液進行HA效價測定，將HA陽性的尿囊液進行NDV RT-PCR擴增，電泳結果如圖3所示，被檢尿囊液均為NDV陽性。對PCR產物進行序列測定，結果與預期一致，表明重組病毒rTS-tPAs-Cap/N構建成功。

M.DL2000 DNA Marker；1～3.3個重組病毒rTS-tPAs-Cap/N的PCR條帶

2.3 重組病毒表達Cap蛋白的鑒定重組病毒rTS-tPAs-Cap/N感染BHK-21細胞后，分別以Western blot法和間接免疫熒光法鑒定Cap蛋白的表達。Western blot檢測結果如圖4所示，以PCⅦ陽性血清為一抗，重組病毒感染的BHK-21細胞顯示出特異性條帶，與預期大小(21 kDa)基本一致。間接免疫熒光檢測結果如圖5所示，rTS-tPAs-Cap/N感染的細胞內同時檢測到了NDV蛋白和Cap蛋白的表達，對照空白細胞均未檢測到陽性信號。結果證實重組病毒rTS-tPAs-Cap/N可在BHK-21細胞內高效表達Cap蛋白。

M.蛋白質Marker；1.重組病毒pTS-tPAs-Cap/N感染的BHK-21細胞；2.BHK-21細胞

圖5 重組病毒rTS-tPAs-Cap/N感染BHK-21細胞后的Cap蛋白表達(400×)

2.4 重組病毒的生物學特性為研究在NDV TS09-C株的P和M基因之間插入Cap基因是否改變其生物學特性，測定了重組病毒的雞胚增殖滴度、細胞生長曲線、耐熱特性和致病性，并與親本rTS09-C株進行了比較。結果顯示，重組病毒rTS-tPAs-Cap/N與親本株有相近的增殖特性，其雞胚增殖滴度為108.25EID50/mL，感染BHK-21細胞后于48～72 h達到平臺期，滴度為106.75TCID50/mL(圖6)。重組病毒rTS-tPAs-Cap/N經過56℃處理150 min后仍具有雞胚感染性，保持了親本株耐熱的特性，而LaSota株經56℃處理60 min已經失去雞胚感染性(表2)。重組病毒rTS-tPAs-Cap/N的MDT/MLD值大于120 h，保持了其弱毒特性。上述結果表明，Cap基因的插入未顯著改變TS09-C株的耐熱、弱毒和高增殖滴度的特性。

表2 病毒雞胚耐熱特性測定

圖6 重組病毒rTS-tPAs-Cap/N在BHK-21細胞的生長曲線

2.5 重組病毒的免疫原性為評估重組病毒rTS-tPAs-Cap/N誘導機體產生針對PCV2的免疫反應，以小鼠為動物模型，分別通過肌肉(i.m)和腹腔(i.p)注射2種途徑進行重組病毒免疫，同時設置滅活疫苗(inactivated vaccine)和空白(control)2個對照組。分別在首免和二免2周后采集血清，以ELISA法測定PCV2抗體水平。除對照組外，其余3組均為PCV2抗體陽性。具體抗體水平如圖7所示，與對照組相比，免疫重組病毒rTS-tPAs-Cap/N誘導小鼠產生了較高的PCV2抗體反應，但略低于滅活疫苗組。腹腔途徑的免疫效果優于肌肉途徑。二免并未顯著增強各試驗組的抗體反應。因此，重組病毒rTS-tPAs-Cap/N免疫小鼠可誘導較強的PCV2抗體反應。

圖7 重組病毒免疫小鼠血清的PCV2抗體檢測

3 討論

國內上市的PCV2疫苗以全病毒滅活疫苗為主[5]，但是PCV2在細胞上的增殖效價不高，且不引起細胞病變，給滅活疫苗的研發和生產造成很大困難。長期以來，各國學者都致力于研發表達PCV2 Cap蛋白的重組腺病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環病毒1型等活載體疫苗[23-25]，已展現出良好的應用前景。

NDV作為疫苗載體有巨大的潛力，其穩定性好，在多次傳代后依然穩定地表達外源基因，對動物可產生良好的保護效果。由于NDV弱毒株在哺乳動物細胞中的復制能力受到限制，NDV活載體疫苗具有較好的安全性[26]。外源基因在NDV基因組的插入位置會顯著影響其表達水平。WEN等[21]研究表明，在P和M基因之間插入GFP基因的重組TS09-C株既保持了親本病毒的高細胞增殖特性，也能高效表達GFP[27]。

tPA信號肽可高效引導重組蛋白在哺乳動物細胞內的分泌表達，是應用較為廣泛的外源信號肽之一。LUO等[28]研究表明，當將禽流感病毒NP蛋白的信號肽序列替換為tPAs后，重組質粒在293細胞中的NP表達量得到了顯著提升，且分泌型NP蛋白的表達量也顯著增加。免疫小鼠后，重組NP質粒可誘導高水平的NP特異性抗體和CD8+T 細胞免疫反應。Cap蛋白是PCV2唯一的結構蛋白，在表達后不定位于細胞膜上，而是由其NLS高效地引導至細胞核中[29]，參與病毒衣殼化。為了促進Cap蛋白的分泌型表達，本研究用 tPAs信號肽替換了Cap蛋白自身的NLS[30]。

以NDV耐熱弱毒株制備的NDV活疫苗具有耐熱、低毒力、可同群感染、免疫方式簡便(拌料、飲水等)等優點，在發展中國家，特別是適合氣溫較高地區或冷鏈系統不完備的農村地區的廣泛應用。本研究以NDV耐熱弱毒株為載體，構建獲得了表達PVC2 Cap蛋白的重組NDV rTS-tPAs-Cap/N株，該重組病毒保持了親本株的耐熱、弱毒、高細胞增殖滴度等優點，且可誘導小鼠產生較高的PCV2抗體反應，具有良好的免疫原性。下一步將開展其豬體動物實驗，研究其對PCV2的攻毒保護效力。為研發高效、安全、熱穩定性強的新型PCV2活載體疫苗打下了良好的前期工作基礎。