豬偽狂犬病病毒gE37～243蛋白的原核表達及gE蛋白抗體間接ELISA的建立

凌蒙蒙，孫藝學，鄧效禹，王 楊，張鵬舉，叢彥龍*

(1.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062；2.長春大學 政策法規(guī)辦公室，吉林 長春 130022；3.中國農(nóng)業(yè)科學院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；4.吉林省農(nóng)業(yè)科學院 動物生物技術研究所，吉林 長春 130033)

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是一種急性、高度接觸性傳染病，其病原為偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)[1]。1813年，美國首次在牛身上發(fā)現(xiàn)了一種以強烈瘙癢為特征的疾病，1849年瑞士也出現(xiàn)了類似的疾病，由于牛和犬感染該病后癥狀相似，被誤認為是狂犬病[2]。直到1902年匈牙利才將該病與狂犬病區(qū)分開來，并將其命名為偽狂犬病(PR)[3]。PR自1813年發(fā)現(xiàn)以來，嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。利用改良的基因缺失活疫苗免疫以及ELISA檢疫等綜合防控措施，美國和一些歐洲國家已經(jīng)將PR消滅[4]。1947年，在我國首次發(fā)現(xiàn)PR[5]。由于使用了Bartha-K61疫苗，在過去30年里PR在我國的防控工作取得了巨大的成功。然而在2011年底，我國自接種了Bartha-K61疫苗的豬群中分離到了PRV[7]。此次PR疫情在各地迅速蔓延，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重的經(jīng)濟打擊。人工感染試驗表明，此次新出現(xiàn)的病毒比以前已知的病毒毒力更強。

PRV編碼至少10種糖蛋白[8]，其中gE蛋白是一種囊膜糖蛋白，其參與病毒的傳播并促進PRV的釋放。有研究表明，缺失gE基因的PRV毒株對豬中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的嗅覺和三叉神經(jīng)的二級和三級神經(jīng)元的感染能力降低。gE蛋白也是PRV毒力的決定因子之一，但它并不是病毒體外復制所必需的蛋白。所以當gE基因缺失時，并不影響PRV的復制和抗原性，但其毒力大大降低[9]。因此目前大部分商品化疫苗均采用缺失gE基因的活疫苗。由于自然PRV毒株中都存在gE基因，因此動物感染野毒后能檢測到gE蛋白的抗體。以上這些特點使gE成為PR血清學診斷的理想靶標。gE缺失疫苗免疫結合gE抗體的檢測是全球公認的凈化PR的根本方法。但我國PRV gE抗體檢測試劑盒仍然依賴進口，還沒有研發(fā)出基于本國國情的具有自主知識產(chǎn)權的試劑盒。基于此，本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)表達了PRV gE的優(yōu)勢抗原表位，并以其為包被抗原建立了檢測PRV gE抗體的間接ELISA方法,從而為鑒別PRV野毒感染與疫苗免疫提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 毒株、載體、菌種及血清豬PRV湯陰株、pET-32a(+)載體由實驗室保存；感受態(tài)細胞Rosetta(DE3)購自北京天根生化科技有限公司；PRV、PRRSV、CSFV和PCV2等陰陽性血清由河北省某養(yǎng)豬場提供，其中PRV、PRRSV和CSFV陰陽性血清經(jīng)IDEXX ELISA試劑盒鑒定，PCV2陰陽性血清經(jīng)北京百奧萊博科技有限公司ELISA試劑盒鑒定。

1.2 主要試劑2×Pfu PCR MasterMix、DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司；DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；SalⅠ、KpnⅠ購自NEB公司；T4DNA Ligase購自Thermo公司；質粒小提試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；抗His標簽鼠單克隆抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；HPR標記羊抗豬IgG購自Solarbio公司；牛血清白蛋白(BSA)購自Seebio公司；顯色液TMB購自北京梅科萬德有限公司。Ni-NTA Agarose購自Qiagen公司；PRV gE糖蛋白阻斷ELISA抗體檢測試劑盒購自西班牙海博萊生物大藥廠。

1.3 目的基因擴增及表達質粒構建根據(jù)gE基因序列，設計了1對擴增gE37～243的引物。引物序列如下：gE37～243-F：5′-GGGGTACCGAGGTTCCATCCCCATCTG-3′；gE37～243-R：5′-ACGCGTCG-ACGAGAATTTCACTGCCACC-3′。用T4連接酶將酶切后的目的片段與pET-32a(+)載體在25℃下進行連接。30 min后，將連接產(chǎn)物轉化至DE3感受態(tài)細胞。涂板后挑取單菌落進行搖菌，經(jīng)菌液PCR鑒定正確后提取質粒并測序，將測序正確的質粒命名為pET-gE37～243。

1.4 重組蛋白表達將pET-gE37～243培養(yǎng)菌液接種于含Cmr+和Amp+的LB液體培養(yǎng)基，37℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)至D600=0.6～0.8，取出200 μL菌液作為對照，而在剩余菌液中加入終濃度為0.25 mmol/L 的IPTG進行誘導。 3 h左右時取出200 μL誘導菌液，13 000 r/min離心1 min，棄上清。用40 μL PBS重懸沉淀后，加入8 μL 5×loading Buffer，沸水煮5～10 min后， 12 000 r/min離心3 min，取上清進行SDS-PAGE電泳，觀察蛋白表達情況。

1.5 重組蛋白純化與Western blot鑒定根據(jù)Ni-NTA Agarose說明書對目的蛋白進行純化，純化后的蛋白于1×PBS中4℃透析過夜。透析后的蛋白先經(jīng)SDS-PAGE電泳，然后轉移至硝酸纖維素膜上進行Western blot鑒定。

1.6 間接ELISA方法的建立

1.6.1抗原包被質量濃度及最佳樣品稀釋倍數(shù)的確定 通過棋盤法確定抗原包被濃度以及被檢血清樣品的最佳稀釋度，具體步驟如下：用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將0.5 mg/L的純化蛋白稀釋至0.03 125 mg/L，100 μL/孔，4℃包被過夜。用含0.1%吐溫的PBS洗滌3次后加入1% BSA，37℃封閉2 h。洗版后每孔加入PBS稀釋的豬血清，稀釋度依次為：1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，37℃孵育1 h。洗滌后加入1∶2 000倍稀釋的HPR標記羊抗豬IgG酶標抗體，100 μL/孔，37℃孵育1 h。洗板后每孔加入100 μL的TMB顯色液，37℃避光顯色10 min。10 min后立即加入50 μL 0.05 mol/L H2SO4終止反應，然后測定D450值。

1.6.2間接ELISA檢測方法判定標準的確定 采用本研究所建立的PRV抗體檢測間接ELISA方法對50份標準陽性血清樣本進行檢測，同時檢測SPF豬血清作為對照。測定D450值，經(jīng)統(tǒng)計學分析確定ELISA檢測方法的判定標準。

1.6.3敏感性和特異性檢測 采用本研究所建立的檢測PRV gE抗體的間接ELISA方法，檢測30份陽性豬血清樣本，根據(jù)檢測結果評價本研究所建立方法的敏感性。此外，對32份PRRSV陽性血清、PCV2陽性血清、CSFV陽性血清以及PRV gE缺失苗免疫的豬血清進行檢測，以確定所建立的方法的特異性。

1.6.4重復性檢測 取同一批次以及不同批次的酶標板各6塊，檢測陽性樣品和陰性樣本，分別計算批內和批間變異系數(shù)，以評價本研究所建立方法的重復性。

1.6.5符合率檢測 采用本研究所建立的間接ELISA方法檢測30份陽性豬血清樣本及45份陰性樣本，并與PRV gE糖蛋白阻斷ELISA抗體檢測試劑盒進行對比，進而評價所建立方法的檢測性能。

2 結果

2.1 目的基因擴增與菌液PCR鑒定將PCR擴增的gE37～243基因產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見約在681 bp處出現(xiàn)1條目的條帶(圖1)。pET-gE37～243菌液PCR鑒定結果顯示，擴增條帶與預期大小相符(圖2)，表明重組質粒pET-gE37～243構建正確。

M.DL2000 Marker；1.gE37～243基因

M.DL2000 DNA Marker；1.pET-gE37～243重組質粒

2.2 gE37～243蛋白純化及Western blot分析將誘導前后的菌液進行SDS-PAGE電泳。結果顯示，在菌液上清中檢測到1條約45 kDa的條帶(圖3)，表明gE37～243蛋白在菌液上清中以分泌方式表達。對gE37～243蛋白上清進行Ni-NTA純化，得到質量濃度為42 mg/L的較純目的蛋白(圖4)。Western blot分析結果表明gE37～243蛋白可以與抗His標簽單克隆抗體結合，表明目的蛋白純化成功。

M.蛋白質相對分子質量標準；1.pET-32a(+)對照上清；2.pET-32a(+)對照沉淀；3.pET-gE37～243誘導前；4.pET-gE37～243誘導后

M.蛋白質相對分子質量標準；1.gE37～243蛋白純化前；2.gE37～243蛋白純化后；3.gE37～243蛋白與His單抗反應

2.3 間接ELISA檢測方法的建立

2.3.1抗原最佳包被濃度和最佳血清樣品稀釋倍數(shù)的確定 由表1可知，當抗原質量濃度和血清的稀釋倍數(shù)分別為0.25 mg/L和1∶80時，陽性值(P值)更接近1，陰性值(N值)小于0.3。因此抗原質量濃度是0.25 mg/L和抗體稀釋倍數(shù)是1∶80是本方法的最佳工作濃度。

表1 抗原包被質量濃度和血清樣品稀釋倍數(shù)優(yōu)化結果

2.3.2間接ELISA檢測方法判定標準的確定 利用所建立的檢測PRV gE抗體的間接ELISA方法對SPF豬血清和50份PRV陽性血清進行檢測，發(fā)現(xiàn)陽性血清D值和陰性血清D值的比值(S/N)均大于2.0。據(jù)此，判定為陽性的標準為S/N>2.0。

2.3.3敏感性和特異性確定 根據(jù)敏感性計算公式Sens itivity=TP/(TP+FN)×100(TP代表真陽性，F(xiàn)N代表假陰性)評價本研究所建立方法的敏感性。經(jīng)過計算，在對30份PRV陽性血清進行檢測過程中其敏感性為93.33%。根據(jù)特異性計算公式Specificity=TN/(TN+FP)×100，對32份PRRSV陽性血清、PCV2陽性血清、CSFV陽性血清以及PRV gE缺失苗免疫的豬血清進行檢測。經(jīng)過計算，本方法的特異性為93.75%。

2.3.4重復性確定 利用所建立的檢測PRV gE抗體的間接ELISA方法進行重復性試驗，結果如表2所示。其中，批內變異系數(shù)為2.175%～9.272%，批間變異系數(shù)為2.443%～7.688%，均低于10%。由此表明該方法具有較好的重復性。

表2 重復性試驗結果

2.3.5與商品化試劑盒檢測結果比較 分別采用本研究所建立的檢測PRV gE抗體的間接ELISA方法和PRV gE糖蛋白阻斷抗體檢測試劑盒同時檢測30份豬血清陽性樣本及45份陰性樣本，并對比兩者的檢測結果。由符合率計算公式Coincidence=(TP+TN) / (TP+FN+TN+FP)×100計算結果可知，兩種方法的符合率可達92.00%(表3)。

表3 間接ELISA和阻斷ELISA對臨床樣本檢測結果對比

3 討論

豬PR自2011年底在我國再次暴發(fā)，已成為當前危害我國養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的疾病之一。我國政府要求全國所有種豬場到2020年將PR達到凈化標準[10]。gE缺失疫苗和gE抗體血清學檢測相結合的方法是目前凈化和防控PR最有效的方法。目前常用的gE抗體檢測血清學方法包括乳膠凝集實驗、瓊脂擴散試驗和ELISA等。由于ELISA方法的特異性、準確性、敏感性和檢出率更高而受到檢測人員的廣泛關注。

PRV gE基因的開放閱讀框長度約為1 731 bp，可編碼577個氨基酸。研究表明，當在大腸桿菌中表達全長gE蛋白時，由于gE蛋白在內質網(wǎng)中的積累，抑制了gE蛋白的合成，導致很難在系統(tǒng)中成功表達全長gE基因[11]。因此，本研究選擇在E.coliRosetta(DE3)中表達gE蛋白的主要抗原表位區(qū)，并利用獲得的目的蛋白作為包被抗原建立了檢測gE抗體的間接ELISA方法。結果顯示，該方法的敏感性和特異性分別為93.33%和93.75%，批內和批間變異系數(shù)均低于10%，與商品化試劑盒的符合率為92.00%。由此表明，本研究所建立的檢測PRV gE抗體的間接ELISA方法具有較好的敏感性、特異性和重復性，能夠滿足鑒別PRV野毒感染和疫苗免疫的需求，該方法為國內PR的凈化提供了技術支持。