基于非洲豬瘟病毒CD2v基因TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立

韓 玉，王 濤，潘 力，孫茂文，周萍萍，王 冰，王 翌，羅玉子，仇華吉，孫 元

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種高度接觸性、廣泛出血性的豬烈性傳染病，死亡率可達100%。該病在撒哈拉以南非洲地區已經流行多年，在過去10多年中，主要在高加索地區和東歐地區流行，自2018年傳入中國以來迅速蔓延至全國各地，并存在進一步擴大的風險，給養豬業造成了無法預估的經濟損失[1-2]。

ASFV為非洲豬瘟相關病毒科(Asfarviridae)非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)的成員[3]，也是目前已知的唯一蟲媒DNA病毒，主要通過病豬/帶毒豬及其污染的產品與易感豬之間的直接接觸或通過鈍緣蜱屬軟蜱傳播。ASFV具有嚴格的細胞嗜性，主要感染巨噬細胞(macrophages)和外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)[4]。ASFV基因組為雙鏈閉合線性DNA分子，不同分離株的基因組大小在170～194 kb之間，可編碼160多種蛋白[3-4]。CD2v作為ASFV重要的囊膜糖蛋白，胞外域含有2個免疫球蛋白樣結構域和信號肽，與淋巴細胞CD2蛋白高度同源，可將紅細胞聚集在表達CD2v的細胞表面[5]。CD2v介導的ASFV與紅細胞結合也有助于病毒在動物體內的擴散和免疫逃逸，但具體的分子機制目前未知。另外，目前已經鑒定出CD2v上存在4個T細胞表位區域，這表明在ASFV感染時誘導產生了針對CD2v蛋白的細胞免疫應答[6]。近幾年研究表明，ASFV基因缺失減毒活疫苗是最有希望成功的一種疫苗，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所構建的7基因缺失病毒(MGF505-1R、MGF360-2R、MGF360-3R、MGF-360-12L、MGF505-13L、MGF505-14L和CD2v)能對中國流行的ASFV強毒株提供完全免疫保護，可作為有效防控中國ASF疫情的疫苗候選株[7]，由此可見，該疫苗候選株具有較好的研發和應用前景。

實時熒光定量PCR檢測方法具有快速、靈敏度高和特異性強的優點，廣泛應用于動物病原的診斷。由于其可以準確對病原進行定量，該方法也被大量應用于基礎研究。基于此，本研究以ASFV中國流行株的重要基因CD2v為靶標，建立針對ASFVCD2v的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法，并對該方法進行初步評價，以期為后續ASFVCD2v基因功能研究及野毒株與CD2v基因缺失毒株的鑒別檢測奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞ASFV/HLJ-18株(MK333180.1)由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所豬烈性傳染病創新團隊(本實驗室)分離鑒定并保存；ASFVCD2v基因缺失毒株(ASFV-ΔCD2v株)由本實驗室構建并保存；ASFV/HLJ-18株(ASFV)的核酸樣品由本研究組提取并保存；豬瘟病毒(CSFV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬圓環病毒1型(PCV1)和豬圓環病毒2型(PCV2)核酸樣品均由本實驗室保存；無特定病原體豬(SPF豬)的肺泡巨噬細胞(PAM)由本實驗室分離并保存；30份臨床樣品來自2019年本團隊保存的送檢病料，包括抗凝血和鼻拭子。

1.2 主要試劑AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA提取試劑盒購自康寧生命科學(吳江)有限公司；Premix PrimeSTAR HS和Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)均購自寶生物工程(大連)有限公司；pOK12載體由本研究組保存；DH5α感受態菌、DNA凝膠回收試劑盒和質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Antibiotic-Antimycotic和RPMI 1640含L-谷氨酰胺培養基購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 引物及探針參考GenBank中的ASFV全基因組(MK333180.1)，選擇CD2v基因序列設計引物CD2v-F/CD2v-R用于構建陽性質粒標準品，擴增的片段長度為811 bp；引物C-F/C-R/C-P為熒光定量PCR的上、下游特異性引物和探針，片段大小為101 bp；以上所有引物和探針的序列見表1，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 本研究所用的引物

1.4 陽性質粒標準品的構建與鑒定以本實驗室保存的ASFV/HLJ-18株核酸為模板，使用引物CD2v-F/CD2v-R擴增目的基因，反應條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環；72℃ 10 min；PCR產物回收純化后，按照ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit說明書將其克隆至經EcoRⅠ酶切的pOK12載體，構建重組質粒pOK12-CD2v，經PCR和測序鑒定正確后作為質粒標準品。采用超微量分光光度計測定重組質粒標準品濃度，根據公式：拷貝數=(6.02×1023拷貝數/mol) × DNA量(g)/[DNA長度(堿基數)×660 Da/堿基]，計算標準品拷貝數。

1.5 熒光定量PCR標準曲線的建立將已知拷貝數的質粒標準品10倍梯度稀釋(1.6×101～1.6×108拷貝 /μL)，并以每個稀釋度的質粒標準品為模板按照已優化的條件進行TaqMan熒光定量PCR擴增。反應體系為25 μL：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)12.5 μL、ddH2O 8.25 μL、上、下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)、探針1 μL(5 μmol/L)、模板2 μL、ROX 0.25 μL；反應條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，55℃ 10 s，延伸72℃ 20 s，共40個循環。對不同濃度的質粒標準品及陰性對照設置3個重復。反應結束后得到動力學曲線，并根據結果繪制出相應的標準曲線。

1.6 特異性試驗以CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV1、PCV2和ASFV/HLJ-18的核酸為模板，按照1.5已優化的條件，同時進行TaqMan熒光定量PCR擴增，評價該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗將構建的質粒標準品10倍梯度稀釋后(1.6×100～1.6×1010拷貝/μL)，利用引物CD2v-F/CD2v-R進行常規PCR擴增；同時按照已優化的條件以本研究所建立的ASFVCD2v基因TaqMan熒光定量PCR進行擴增，比較兩者的結果以確定該方法的敏感性。

1.8 重復性試驗選取1.6×103～1.6×107拷貝/μL共5個濃度的標準品質粒為模板，每個濃度5個重復，按照已優化的條件進行熒光定量PCR擴增，進行組內重復性試驗。在不同時間點分別檢測3次，進行組間重復性試驗。根據檢測所得Ct值計算組內和組間的變異系數，初步評估該方法的重復性。

1.9 ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株的鑒別診斷首先，將本實驗室分離的PAM細胞計數后分裝在12孔細胞培養板(每孔約含細胞1.0×105個)；然后，共設置3個試驗組分別為：ASFV/HLJ-18組、ASFV/HLJ-18-ΔCD2v組和空白對照組，每組3個重復，并按照MOI = 1的劑量同步感染ASFV/HLJ-18和ASFV/HLJ-18-ΔCD2v，置于5% CO2細胞培養箱中培養48 h，分別收取ASFV/HLJ-18、ASFV/HLJ-18-ΔCD2v感染和空白對照組的上清，按照AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA，然后利用本研究建立的方法進行擴增；最后，根據擴增結果判斷ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株的鑒別診斷效果。

1.10 臨床樣品檢測取本實驗室保存的30份臨床樣品，包括鼻拭子和抗凝血，解凍后將鼻拭子震蕩后瞬時離心取200 μL上清備用，抗凝血直接取200 μL 備用，參照AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA提取試劑盒說明書步驟進行操作提取DNA。利用本實驗室先前建立的ASFV熒光定量檢測方法[8]與本研究所建立的方法同時對臨床樣品進行檢測，比較這兩種方法的一致性和差異是否具有統計學意義，并計算兩者的符合率。

1.11 統計學分析利用SPSS 24.0軟件進行一致性和配對卡方檢驗，比較2種檢測方法的結果，Kappa值>0.75，則認為2種方法的一致性較好，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 標準品的制備以本實驗室保存的ASFV/HLJ-18株核酸為模板進行PCR擴增，得到大小為811 bp的目的條帶(圖1)，與預期相符。將目的片段克隆至pOK12載體上，構建含CD2v基因的質粒標準品，經測序鑒定后，提取質粒標準品并測定其濃度為516 ng/μL，經過計算拷貝數為1.6×1011拷貝/μL。表明，重組質粒標準品pOK12-CD2v正確構建。

M.DL2 000 DNA Marker;1.CD2v Gene;2.Negative control

2.2 ASFVCD2v基因熒光定量PCR標準曲線的建立將1.6×101～1.6×108拷貝 /μL質粒標準品按照已優化的反應條件進行TaqMan熒光定量PCR擴增，使用QuantStudioTMDesign & Analysis Software v1.4.3分析軟件繪制其標準曲線(圖2)，得到線性回歸方程為：y= -3.241x+43.259，其中y為Ct值，x為標準品拷貝數的對數值，R2為0.998，擴增效率為103.5%，最低檢測限為16拷貝 /μL。

圖2 ASFV CD2v基因標準曲線的建立

2.3 ASFV CD2v基因熒光定量PCR的特異性試驗結果利用本研究建立的TaqMan熒光定量PCR方法對CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV1、PCV2和ASFV/HLJ-18的核酸(cDNA/DNA)進行擴增，結果顯示僅ASFV/HLJ-18的DNA出現擴增曲線，其余病毒核酸和陰性對照均未出現擴增曲線(圖3)。表明該檢測方法中設計的引物和探針特異性強。

2.4 ASFV CD2v基因熒光定量PCR的敏感性試驗結果將10倍梯度稀釋的重組質粒標準品進行熒光定量PCR和常規PCR擴增。結果顯示，本研究建立的針對ASFVCD2v基因的TaqMan熒光定量PCR方法對重組質粒標準品的最低檢測限為16拷貝/μL(圖4A)，常規PCR能夠檢測到的重組質粒標準品的最低檢測限為1.6×104拷貝/μL(圖4B)；該方法比常規PCR檢測方法的敏感性高出3個數量級。

A.1～8.1.6×107～1.6×100copies/μL plasmid standard;9.Negative control;B.M.DL2000 DNA Marker;1～10.1.6×1010～1.6×101 copies/μL plasmid standard;11.Negative control

2.5 ASFV CD2v基因熒光定量PCR的重復性試驗結果取10倍梯度稀釋得到的1.6×103～1.6×107拷貝/μL共5個濃度的標準品質粒，按照相同的條件進行熒光定量PCR擴增；結果顯示，組內變異系數(CV)均小于1%，組間變異系數(CV)均小于2%，表明本檢測方法的重復性和穩定性良好(表2)。

表2 ASFV CD2v基因TaqMan實時熒光定量PCR的重復性試驗

2.6 ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株的檢測結果利用該方法檢測在陽性對照與陰性對照成立的情況下，ASFV/HLJ-18株核酸的Ct值平均為24.1，能夠特異性擴增，而ASFV/HLJ-18-ΔCD2v株的核酸無Ct值，沒有擴增(圖5)。表明該方法能夠有效地鑒別ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株。

圖5 ASFV CD2v野毒株與基因缺失毒株與的檢測結果

2.7 臨床樣品的檢測結果運用本研究建立的針對ASFVCD2v的TaqMan熒光定量PCR檢測方法和之前本實驗室建立的針對ASFVp72基因的TaqMan熒光定量PCR檢測方法同時對30份臨床樣品進行檢測，陽性符合率為100%(13/13)，陰性符合率為82%(14/17)，總符合率為90%(27/30)。McNemer檢驗的結果，P> 0.05，表明兩種檢測方法結果無統計學差異；Kappa檢驗的結果，Kappa = 0.802>0.75，提示這兩種檢測方法一致性較高(表3)。

表3 兩種方法的檢測結果

3 討論

ASFV的結構復雜、基因組十分龐大，目前超過半數的基因功能未知，這嚴重制約了ASFV感染和致病機制的研究。經過多年對CD2v的研究發現，該蛋白在ASFV的傳播和免疫逃逸中發揮重要作用，但具體分子機制尚不清楚[4]，因此關于CD2v的功能有必要進一步研究。ASFVCD2v基因缺失病毒在病毒與宿主互作研究中發揮重要作用，有助于解析其功能。目前主要通過同源重組方法來構建ASFV基因缺失病毒，由于重組率極低，其中關鍵的一步是通過空斑純化或/和有限稀釋法對重組病毒進行純化，最后需要對重組病毒進行鑒定，篩查是否還存在野毒株。常規PCR敏感性低，若親本毒含量極低，則會出現假陰性而導致誤判，實時熒光定量PCR檢測方法很好的填補了這個缺陷。

ASF對全球養豬業的危害日益嚴重，因此亟需開展綜合防控技術及疫苗研發[9]。在過去的幾十年中，科學家們對不同類型的ASF疫苗進行了評估。其中滅活疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗和腺病毒載體疫苗的免疫保護效果不盡人意。相比之下，減毒活疫苗和基因缺失疫苗具有一定優勢[10]。國內外相關研究已證實，不同基因型的ASFVCD2v單缺失毒株致弱效果差異較大：ASFV BA71株(基因Ⅰ型)缺失CD2v后完全致弱且免疫后具有完全交叉保護效果[11]，Malawi LiL-20/1(基因Ⅷ型)缺失CD2v未能致弱[12]，而國內流行毒株(基因Ⅱ型)缺失CD2v后進行免疫，存活率為0～75%不等[7,13]。但是，我國研發的包含CD2v在內的ASFV 7基因缺失毒株可針對中國流行的ASFV強毒株提供完全免疫保護，將來可能應用于市場，故而亟需配套的鑒別診斷方法來區分ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株[7]。基于以上分析，本研究建立了以CD2v為靶基因的TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。

本研究建立的TaqMan熒光定量PCR方法特異性強、靈敏度高、重復性好。該方法可以特異性檢測ASFV，與CSFV、PRV、PRRSV、TGEV、PCV1和PCV2等豬的多種常見病原不存在交叉反應；該方法最低可檢測16拷貝/μL的ASFV核酸，比常規PCR檢測方法的敏感性高出3個數量級；同時，組內和組間變異系數都小于2%；另外，該方法能夠有效地鑒別ASFV野毒株和CD2v基因缺失毒株，與本實驗室先前建立的針對ASFVp72基因的熒光定量PCR檢測方法相比無統計學差異且符合率較高，因此也可使用該方法對疑似樣品進行再次驗證。自ASF傳入我國以來，給我國養豬業造成了巨大的經濟損失。結合ASF復雜的流行病學特點及我國養豬業現狀，該病的防控和根除將是一場艱難的持久戰[14]，因此十分有必要對ASFV展開深入系統的研究。本研究建立的針對ASFVCD2v基因的TaqMan熒光定量PCR方法不僅豐富了ASFV的診斷靶標，也為今后ASFV的基礎研究提供良好技術支持。