重組豬GM-CSF提高非洲豬瘟病毒在骨髓細胞中的產量

岳慧賢,張艷艷,陳 騰,楊金金,楊金梅,郭曉盼,張 菲,張守峰,王 穎,韓 栒,扈榮良

(軍事科學院 軍事醫學研究院 軍事獸醫研究所,吉林 長春 130122)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的家豬和野豬的烈性傳染病。2018年8月初，非洲豬瘟疫情傳入我國并迅速傳播，防控形勢十分嚴峻。由于該病給我國的養豬業造成了巨大的經濟損失，在我國目前客觀條件下，開發安全可靠的疫苗已成為防控的關鍵。研究中的非洲豬瘟疫苗主要包括滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗等[1]，其中減毒活疫苗是目前效果最好的候選疫苗。在減毒活疫苗生產工藝研究中，減毒株的培養及病毒滴度的提高是其中關鍵。

據報道，盡管重組ASFV可在某些傳代細胞系復制，但均無法進行連續穩定傳代和高滴度培養增殖。原代肺泡巨噬細胞和骨髓細胞是目前用來分離和培養ASFV的主要培養介質[1,2]。我們在原代細胞的分離培養過程中發現，即使是SPF豬，因呼吸系統處于開放狀態，其肺泡巨噬細胞的微生物污染情況仍較為嚴重，存在如豬4型腺病毒、支原體、圓環病毒等污染。相對而言，骨髓處于生理封閉狀態，細胞病原體污染輕微，是目前疫苗生產中培養ASFV的理想選擇，但以未分化骨髓細胞培養ASFV時，病毒滴度較低，導致實際免疫成本過高。由于ASFV對髓系來源的單核-巨噬細胞(單核細胞、巨噬細胞以及樹突狀細胞)易感性最強[3]，因而，本研究擬誘導骨髓細胞分化為巨噬細胞或樹突狀細胞，以提高病毒滴度，優化疫苗生產工藝。

粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)介導細胞增殖和存活的各種信號，在誘導造血干細胞前體集落分化成粒細胞和巨噬細胞方面具有重要作用[4]。在豬骨髓細胞培養分化相關研究中，重組豬GM-CSF(rpGM-CSF)被廣泛用以誘導生成骨髓巨噬細胞( bone marrow-derived macrophages,BMDMs )和骨髓樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cells，BMDCs)[5-6]。我們以市售進口rpGM-CSF(R&D公司)進行相關試驗也證實可行，但市售產品價格昂貴，供貨期長且國內缺乏穩定供應，給疫苗生產帶來不可控風險。鑒于rpGM-CSF誘導分化后的豬骨髓源細胞對ASFV感染和增殖能力影響尚無詳細報道，為完善和優化非洲豬瘟疫苗生產工藝，本研究對構建和表達了重組豬GM-CSF，并對其促進骨髓細胞分化，進而提高ASFV培養滴度的特性進行了初步研究，旨在通過自主研發為非洲豬瘟疫苗生產提供穩定可靠的重組豬GM-CSF。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株和載體 大腸埃希菌DH5α、Rosetta(DE3)；原核表達載體pET32a均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2豬或豬肋骨 采集新出生2 h內尚未吸吮初乳的仔豬，采用乙醚吸入麻醉的方式實施安樂死。立即剖檢，無菌操作采取肋骨，置滅菌保溫盤內，在生物安全柜內進行骨髓細胞沖洗。

1.1.3骨髓細胞 用注射器吸取骨髓沖洗液(RPMI 1640+5 mmol/L EDTA)，將無菌采集的新生仔豬肋骨固定后，將沖洗液注入骨髓內，沖洗出骨髓細胞，經紗布、細胞篩過濾后，1 400 r/min離心5 min,棄去上清，用5倍體積的紅細胞裂解液重懸，靜置3 min，用30 mL PBS終止反應，1 400 r/min離心5 min，重復裂解，直至紅細胞裂解完全，棄上清，用細胞洗滌液1(1×PBS+5 mmol/L EDTA)重懸，靜置5 min，1 400 r/min，4℃離心5 min。再使用細胞洗滌液II (1×PBS+2% FBS)重懸，靜置5 min，1 400 r/min,4℃離心5 min。使用洗滌液2重復洗滌3次，棄上清，用40 mL RPMI 1640重懸，取100 μL細胞重懸液100倍稀釋進行細胞計數。

1.1.4病毒 ASFV缺失毒(SY18ΔMGF/CD2v),帶紅色熒光標簽，由軍事科學院軍事醫學研究院軍事獸醫研究所保存。

1.1.5主要試劑 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司；預染蛋白質Marker購自Thermo；質粒提取試劑盒購自AXYGEN公司；蛋白預裝柱Histrap hp購自GE lifeEA； IPTG購自寶生物工程(大連)有限公司；RPMI 1640細胞培養基購自Gibico公司；胎牛血清(FBS)購自北京四葉青公司；市售進口rpGM-CSF因子購自R&D公司。

1.1.6主要設備設施 P3實驗室，為軍事獸醫研究所認證通過，Jun ABSL3-004(號)；熒光顯微鏡Olympus IX73。

1.2 方法

1.2.1重組大腸桿菌pGM-CSF的構建及表達 參照NCBI公布的GM-CSF基因序列(Gene ID:397208)設計引物并構建重組質粒pET32a::pGM-CSF。引物由吉林庫美生物有限公司合成，pGM-CSF P1:ATGTGGCTGCAGAACCTGCTTCTCC；pGM-CSF P2:TTACTTTTTGACTGGCCCCCA-GCAG。

將重組的pET32a::pGM-CSF轉化入感受態細胞Rosetta (DE3)；經鑒定正確后，將 Rosetta pET32a::pGM-CSF 與空載對照Rosetta pET32a接種于LB + Amp液體培養基中，待細菌D600的值達到0.6～0.8，加入終濃度為1.0 mmol/L 的IPTG誘導2 h。測各菌液的D600值，各取1D600的菌液，收集菌體，用100 μL的1×protein loading buffer 重懸菌體，煮沸10 min。將樣品進行SDS-PAGE電泳，觀察蛋白是否表達。

1.2.2重組GM-CSF蛋白的純化和鑒定 用500 mL LB液體培養基誘導表達pGM-CSF蛋白，12 000 r/min離心20 min收集菌體；加入含8 mol/L尿素的平衡緩沖液重懸后，超聲破碎取上清，經蛋白預裝柱Histrap hp純化蛋白，收集洗脫液，通過SDS-PAGE電泳分析蛋白的純化產物。 將誘導后的空載Rosetta pET32a、重組表達菌Rosetta pET32a::pGM-CSF、純化后的蛋白經SDS-PAGE電泳后轉印至硝酸纖維素膜上，并以5%脫脂乳封閉，利用HRP標記的His標簽單抗驗證表達的重組蛋白是否帶有His標簽以便后續純化。

1.2.3重組GM-CSF(rpGM-CSF)對骨髓細胞分化的影響 無菌操作取新生仔豬的肋骨，用注射器吸取骨髓沖洗液(RPMI 1640+5 mmol/L EDTA)沖洗出骨髓細胞；經紗布、細胞篩過濾后，1 400 r/min離心5 min,棄去上清，用5倍體積的紅細胞裂解液重懸，靜置3 min，用30 mL PBS終止反應，1 400 r/min離心5min；重復裂解，直至紅細胞裂解完全；棄上清，用細胞洗滌液1(1×PBS+5 mmol/L EDTA)重懸，靜置5 min，1 400 r/min，4℃離心5 min；再使用細胞洗滌液II (1×PBS+2% FBS)重懸，靜置5 min，1 400 r/min,4℃離心5 min；使用洗滌液2重復洗滌3次；棄上清，用RPMI 1640+10%FBS +10 μg/L rpGM-CSF +1×PBS培養基重懸，取100 μL細胞懸液100倍稀釋，進行細胞計數；2×107個細胞/90 mm 皿，每個皿培養液體積為12 mL,5個皿作為1個試驗組；用RPMI 1640+10%FBS +10 μg/L rpGM-CSF +1×PBS培養基重懸細胞，2×106個細胞/90 mm 皿，5個皿作為空白對照組；將細胞培養皿置于二氧化碳培養箱，37℃培養7 d。

培養后的骨髓源細胞，試驗組與對照組分別接入1%的ASFV，在二氧化碳培養箱37℃培養96 h。分別在12,24,48,72和96 h用熒光顯微鏡下觀察細胞的感染情況并拍照。

為了比較本表達產物和市售進口產品的誘導分化效果，將兩者按照如上方法進行效果比較。

1.2.4ASFV缺失株的生長曲線及TCID50測定 為了解ASFV缺失毒(SY18ΔMGF/CD2v)在本表達產物誘導后的骨髓源細胞上的復制能力。將ASFV缺失毒(SY18ΔMGF/CD2v)按照1%的濃度感染本表達產物誘導分化后的骨髓源細胞，并分別于病毒感染后12,24,48,72和96 h收集細胞。凍融2次后，利用豬肺泡巨噬細胞(PAM)做病毒滴度測定，繪制生長曲線。

為比較本表達產物和市售進口產品誘導分化細胞后對病毒培養滴度的影響，分別用兩者誘導的細胞培養ASFV缺失株(SY18ΔMGF/CD2v)培養96 h 后收集細胞，凍融2次后按照10倍系列稀釋，取10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8共6個稀釋度接種至鋪有PAM的96孔細胞板，100 μL/孔，同時設陰性細胞對照8孔。96孔培養板置于37℃培養4～5 d 后，觀察熒光，用Reed-Muench法計算半數細胞感染量(TCID50)。

2 結果

2.1 重組質粒的構建與誘導表達重組質粒pET32a::pGM-CSF經PCR鑒定后，將空質粒Rosetta pET32a、重組質粒Rosetta pET32a-pGM-CSF轉化入表達菌Rosetta中，經終濃度1.0 mmol/L 的IPTG誘導2 h，pGM-CSF蛋白成功表達，目的蛋白的大小約為38 kDa(其中載體標簽Trx、 His-tag及S-tag的總大小約為23 kDa，目的蛋白為14.4 kDa),結果見圖1。結果表明，誘導表達的重組蛋白pGM-CSF約在38 kDa處出現特異性條帶，而空載體在同一位置處未出現任何條帶，表明重組蛋白得到正確表達。

M.蛋白質 Marker；1.Rosetta pET32a；2.Rosetta pET32a::pGM-CSF

2.2 重組pGM-CSF蛋白的純化及Western blot分析誘導表達的菌體離心后，用PBS將菌體重懸，進行超聲破碎，分別對上清和包涵體進行處理，經SDS-PAGE電泳分析，包涵體均在38 kDa有明顯條帶，符合預期條帶大??；利用pGM-CSF蛋白上的組氨酸標簽經親和層析法得到純化的pGM-CSF蛋白。結果顯示，當包涵體經過洗滌后除去大部分雜蛋白，重組蛋白純度可達90%以上。純化后的蛋白進行透析復性，如圖2所示，在38 kDa處出現明顯的條帶。再將誘導表達的Rosetta pET32a、重組表達菌Rosetta pET32a::pGM-CSF、純化的重組蛋白pGM-CSF 經SDS-PAGE后轉印至硝酸纖維膜上，進行Western blot 分析。用His單抗做一抗，檢測到在相同的位置可見特異性條帶，符合預期大小，如圖3所示。

M.蛋白質 Marker;1.Rosetta pET32a::pGM-CSF;2.Rosetta pET32a::pGM-CSF;3.純化的重組蛋白

M.蛋白質Marker;1.Rosetta pET32a::pGM-CSF;2.Rosetta pET32a::pGM-CSF;3.純化的重組蛋白

2.3 重組pGM-CSF蛋白對骨髓源細胞分化的影響將骨髓源細胞在含有10 μg/L rpGM-CSF的培養基培養7 d后，用顯微鏡觀察在骨髓源細胞的分化情況。發現培養后的骨髓源細胞主要分為貼壁與漂浮細胞，其中貼壁細胞約占30%，而漂浮細胞約占70%。而在貼壁的細胞中主要呈現類似巨噬細胞的“煎蛋狀”或球形形態(圖4)；非貼壁細胞中大部分細胞呈現出樹突狀形態，還有一部分細胞形態較小、圓形的未成熟骨髓源前體細胞和粒細胞。同樣用10 μg/L進口的rpGM-CSF做了誘導7 d后，細胞的分化情況與本研究表達的rpGM-CSF產生的誘導效果差別不明顯。

A.巨噬細胞形態黏附細胞;B.樹突狀細胞黏附細胞

本研究體外培養試驗中，骨髓源細胞添加10,20,50和100 μg/L等不同質量濃度的rpGM-CSF培養7 d后，觀察細胞的分化情況。試驗可見添加10,20和50 μg/L等質量濃度的rpGM-CSF時，貼壁細胞的數量沒有顯著的提高，漂浮細胞數量變化不大；而當rpGM-CSF質量濃度提升至100 μg/L時，培養基中的貼壁細胞數量約為55%，非貼壁細胞數量也較多。表明，不同質量濃度的rpGM-CSF對骨髓源細胞分化有較大的影響。

2.4 rpGM-CSF誘導后對病毒增殖的影響將培養7 d的對照組與試驗組分別按1%的接毒量接入ASFV缺失毒(SY18ΔMGF/CD2v)，分別觀察12，24，48，72和96 h等5個時間點接毒后的細胞。光學顯微鏡下可見，細胞變大變圓類似空泡狀或呈葡萄串狀，貼壁細胞逐漸脫落；在熒光顯微鏡下可見，與空白對照組培養基中紅色熒光數相比，加有rpGM-CSF的培養基明顯增多(圖5)。分別收集以上不同時間點的培養物，用生長曲線分析對照組與試驗組的感染性。進一步通過細胞培養基中的病毒滴度來測定對照組和試驗組的病毒復制能力。表明，與對照組相比rpGM-CSF誘導的試驗組的感染力在不同時間段均較強(圖6)。通過病毒滴度測定，試驗組的病毒滴度約是對照組的0.5～1.5個數量級。

圖5 ASFV缺失毒在rpGM-CSF誘導的BMDM中的增殖分析

A.ASFV株在rpGM-CSF培養的骨髓源細胞中的生長曲線;B.不同濃度rpGM-CSF誘導BMDM時ASFV的TCID50

鑒于不同濃度的rpGM-CSF誘導后細胞分化程度不同，病毒的增殖可能會受影響。因此，我們針對10，20和50 μg/L等不同質量濃度rpGM-CSF誘導的細胞進行了TCID50測定，病毒滴度為7.5～7.75 TCID50/mL；而100 μg/L質量濃度的rpGM-CSF誘導的骨髓源細胞培養ASFV缺失病毒(SY18ΔMGF/CD2v)其病毒滴度為8.0～8.25 TCID50/mL。用上述相同的培養方法，進口rpGM-CSF培養后的病毒滴度為6.8～7.25 TCID50/mL。綜上可見，本研究rpGM-CSF誘導的骨髓源細胞對提升ASFV培養滴度具有明顯的作用。

針對本研究制備的rpGM-CSF和進口市售產品在誘導骨髓細胞分化及病毒滴度的比較結果見表1。

表1 rpGM-CSF和進口產品在誘導骨髓細胞分化及病毒滴度的比較結果

3 討論

本研究設計并人工合成了pGM-CSF基因序列，誘導、表達并純化了該蛋白,比較了相同培養條件下的骨髓細胞與用rpGM-CSF誘導的骨髓細胞的分化情況。結果表明，rpGM-CSF誘導后的細胞分化程度良好，細胞培養的病毒滴度顯著高于未誘導的骨髓細胞。這對ASFV骨髓原代細胞培養和相關疫苗的研究提供了重要工具。

截至目前，已有多個文獻報道過用各種細胞細胞因子培養豬骨髓巨噬細胞、DC細胞的方法，如人GM-CSF、小鼠M-CSF、rpGM-CSF等[5,7-8]。本研究用10 μg/L的 rpGM-CSF培養骨髓源細胞7 d后，細胞體積變大變圓，貼壁細胞多數具有巨噬細胞典型特征、貼壁漂浮細胞主要以DC細胞為典型形態。這一試驗結果與KIM 等[6]的研究結果一致，rpGM-CSF培養的豬骨髓源細胞中漂浮細胞大部分為DC細胞，貼壁細胞主要是巨噬細胞。YI等[4]的研究表明，高炎性環境培養的骨髓源細胞可能更傾向于分化為巨噬細胞。本研究發現，低質量濃度rpGM-CSF誘導的骨髓源細胞，貼壁細胞數量并沒有明顯增加；當質量濃度提高至100 μg/L時細胞貼壁數量顯著增加，約是低質量濃度誘導條件的2倍，這些貼壁細胞中約70%具有骨髓巨噬細胞的典型形態，這表明高濃度rpGM-CSF誘導的骨髓源細胞更傾向于分化成骨髓巨噬細胞。

本研究在構建表達載體時，攜帶了載體標簽Trx、S-tag及His-tag，融合蛋白的大小達38 kDa，而目的蛋白pGM-CSF的分子量為14.4 kDa，標簽蛋白的分子量達23 kDa。但從其在細胞培養中生物活性以及和進口產品的效果比較來看，標簽蛋白沒有影響rpGM-CSF的活性。因此，考慮到體外應用，本研究沒有對其作進一步純化和活性的進一步研究。

ASFV不僅能感染骨髓系單核細胞、巨噬細胞，也能感染DC細胞[9]，但對rpGM-CSF培養的骨髓源細胞對重組ASFV缺失株的病毒增殖能力鮮有報道。本研究通過生長曲線分析發現，rpGM-CSF誘導的骨髓源細胞在任一時間點對ASFV的感染能力都強于未誘導的骨髓源細胞，且該培養基中的病毒滴度是未誘導的3～30倍，初步表明骨髓細胞的分化程度能影響ASFV的病毒增殖能力；試驗進一步發現， ASFV在低濃度rpGM-CSF誘導的培養基中病毒滴度相差不大；而高濃度rpGM-CSF誘導的細胞，其病毒滴度8.0～8.25 TCID50/mL。這表明，高度炎性條件下分化的骨髓源細胞對ASFV的感染能力較強，而原因可能與rpGM-CSF誘導后細胞的貼壁數量、細胞的成熟程度有關。一方面高濃度rpGM-CSF誘導的骨髓源細胞傾向于分化為骨髓巨噬細胞，而骨髓巨噬細胞是ASFV主要靶細胞，因而病毒在該培養基的增殖能力可能更強；另一方面成熟的DC細胞對ASFV的易感性較強；高濃度rpGM-CSF培養骨髓源細胞后可能分化為更多成熟的骨髓DC細胞。

本研究結果表明，骨髓源細胞經rpGM-CSF誘導后分化良好，且能使重組ASFV缺失株有較高效率的增殖，這為ASFV的深入研究提供了重要的工具；且與價格昂貴的進口rpGM-CSF相比，本研究表達的rpGM-CSF為非洲豬瘟疫苗大規模工業生產節省了巨大成本。