2017-2019年重慶市自制抗酸染色標本室間質(zhì)量評價結(jié)果分析

王淑玲，顏 令，徐蘭蘭，張 震，李 甜，廖 璞

中國科學(xué)院大學(xué)重慶醫(yī)院檢驗科/重慶市人民醫(yī)院檢驗科/重慶市臨床檢驗中心，重慶 400014

由于人類免疫缺陷病毒感染、人群老年化、空氣污染等因素影響，結(jié)核病發(fā)病率逐年增高，其仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題。世界衛(wèi)生組織(WHO)最新發(fā)布的《2019年全球結(jié)核病報告》顯示，我國仍為全球30個結(jié)核病高負擔國家之一，每年新發(fā)結(jié)核病患者約90萬例，位居全球第3位[1]。及時篩選出結(jié)核帶菌人群，及時隔離及治療，減少結(jié)核病傳播已成為我國傳染病防治的重點。用于診斷結(jié)核病的實驗室技術(shù)雖然發(fā)生了變化，但直接痰涂片抗酸染色仍是診斷和監(jiān)測結(jié)核病的最具成本效益的方法[2]。痰涂片染色顯微鏡檢查錯誤可能會導(dǎo)致無法發(fā)現(xiàn)感染結(jié)核病的患者，而未被檢測到的患者可能會繼續(xù)在社區(qū)中傳播疾病，或進行不必要的治療。為了解本市各級實驗室抗酸染色及顯微鏡檢查能力，提高本市臨床微生物抗酸染色顯微鏡檢查能力，重慶市臨床檢驗中心于2017年下半年開始開展抗酸染色顯微鏡檢查室間質(zhì)量評價(EQA)，至今開展了5次，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)分析如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 膿腫分枝桿菌標準菌株ATCC19977(CICC10381)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2自制EQA標本 在生物安全柜內(nèi)刮取血平板上生長3 d的膿腫分枝桿菌，調(diào)菌懸液到0.50麥氏單位，2%胰蛋白酶37 ℃消化臨床膿痰30 min，分別用消化后的痰液將菌懸液稀釋10倍(4+)、50倍(3+)、100倍(2+)、200倍(1+)，取10 μL不同稀釋倍數(shù)的菌懸液可制備成不同等級的樣品，涂抹玻片中央呈2 cm2菌膜，經(jīng)過穩(wěn)定性和均一性評價合格后方可作為抗酸染色EQA標本[3-4]。

1.2方法

1.2.1標本發(fā)放及檢測 EQA通過批量測試方式進行。重慶市臨床檢驗中心向申請參加EQA的實驗室發(fā)送未染色的涂片標本，由參加實驗室人員自行染色，顯微鏡檢查讀片，然后由重慶市臨床檢驗中心對讀片結(jié)果進行分析評估。EQA標本每年發(fā)放2次，每次5個標本。本市參加EQA的實驗室按照通知，收到標本后立即檢測，或放置室溫保存并在規(guī)定日期前檢測和上報檢測結(jié)果。檢測時按照實驗室臨床標本抗酸染色及顯微鏡檢查操作規(guī)程進行。

1.2.2數(shù)據(jù)收集 依據(jù)CNAS-GL002：2018《能力驗證結(jié)果的統(tǒng)計處理和能力評價指南》[5]，統(tǒng)計參評實驗室對質(zhì)量評價標本的測定結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的符合程度。預(yù)期陰性報告陽性不得分；預(yù)期陽性報告陰性不得分；預(yù)期陽性與預(yù)期上下差1個數(shù)量級皆為符合得20分；預(yù)期陽性標本與預(yù)期上下差2個及以上數(shù)量級得10分。參照WS/T 644-2018《臨床檢驗室間質(zhì)量評價》，根據(jù)符合率來判斷參評實驗室的能力是否合格(合格標準為大于等于80分)。對每一個檢測項目的評價為：(某項目測定結(jié)果可接受標本數(shù)/某項目標本總數(shù))×100=本次某項目測定得分，如果該項目得分大于等于80分則為滿意(合格)；對于所有檢測項目的評價為：(所有項目測定結(jié)果可接受標本數(shù)/標本總數(shù))×100=本次所有項目測定得分，如果所有項目得分大于等于80分則為滿意(合格)[6]。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用Excel 2016對數(shù)據(jù)進行處理。計數(shù)資料以頻數(shù)、率表示。

2 結(jié) 果

2.1參加抗酸染色顯微鏡檢查并上報數(shù)據(jù)的實驗室數(shù)和合格率 參加該項目EQA的實驗室數(shù)從2017年58家增加至2019年88家，合格率從2017年的96.6%增加至2019年的97.7%，見表1。

表1 2017-2019年參加并上報數(shù)據(jù)實驗室數(shù)和合格率

2.2參加抗酸染色顯微鏡檢查實驗室級別構(gòu)成和合格情況 參加EQA的單位主要是綜合性二、三級醫(yī)院和中醫(yī)系統(tǒng)的實驗室，民營醫(yī)院實驗室和獨立實驗室也逐步加入。2019年綜合性二級醫(yī)院實驗室35家，占39.8%，綜合性三級醫(yī)院實驗室24家，占27.3%，系統(tǒng)實驗室20家，占22.7%。參加實驗室合格率逐步上升，見表2。

表2 2017-2019年參加EQA實驗室級別構(gòu)成和合格情況

2.32017-2019年抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果 抗酸染色顯微鏡檢查各標本符合率在88.2%～100.0%，見表3。

表3 2017-2019年抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果

2.4實驗室標本抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果符合情況 5次抗酸染色鏡檢EQA，共發(fā)放陰性標本1 158份，陰性標本符合率97.8%；發(fā)放陽性標本772份，陽性標本符合率98.1%；總體符合率97.9%，見表4。

表4 實驗室標本抗酸染色鏡檢結(jié)果符合情況[n(%)]

2.5實驗室標本抗酸染色顯微鏡檢查錯誤結(jié)果分析 高假陽性(HFP)即陰性標本錯誤報告為2+～4+；高假陰性(HFN)即陽性標本2+～4+錯誤報告為陰性；低假陽性(LFP)即陰性標本報告為1+及以下；低假陰性(LFN)即1+及以下陽性標本錯誤報告為陰性[7-8]。陰性標本1 158份，回報結(jié)果HFP錯誤的占1.1%，LFP錯誤占1.1%；陽性標本772份，回報結(jié)果HFN錯誤的占1.9%；1 930份標本的總錯誤占2.1%，見表5。

表5 實驗室標本抗酸染色顯微鏡檢查錯誤結(jié)果分類[n(%)]

2.6實驗室標本抗酸染色顯微鏡檢查陽性結(jié)果量化誤差(QE) 陽性級別判斷上相差2個及以上數(shù)量級，例如將4+報告為1+/2+或?qū)?+/2+報告為4+[6-7]，772份陽性標本中有42份標本上報結(jié)果存在QE，占5.4%。

2.7涂片抗酸染色儀器使用情況 使用全自動染片儀的實驗室僅有3家，占3.4%，96.6%實驗室仍是傳統(tǒng)人工染色。

3 討 論

WHO在2017年11月全球結(jié)核病部長級會議上重申了到2030年終止結(jié)核病流行的宣言。印度(27%)、中國(14%)和俄羅斯(9%)是全球耐藥結(jié)核病負擔最大的3個國家，我國控制結(jié)核疫情形勢相當嚴峻，發(fā)現(xiàn)病例的創(chuàng)新方法將有助于降低結(jié)核病發(fā)病率[9]。結(jié)核分枝桿菌細胞壁內(nèi)富含的脂質(zhì)和分枝菌酸，可抵抗鹽酸酒精的脫色，苯酚復(fù)紅將其染成紅色。隨著實驗室診斷技術(shù)的發(fā)展，很多先進的技術(shù)被應(yīng)用，如Gene Xpert MTB/RIF檢測具有準確、快速、安全等優(yōu)點，但費用昂貴；培養(yǎng)法雖然靈敏度高，而且能鑒定到菌種和藥敏試驗，但是操作繁瑣，培養(yǎng)時間較長，報告陽性的時間可長達12周[10]。涂片抗酸染色目前仍是各級實驗室檢測結(jié)核分枝桿菌的基本方法。WHO宣布，控制結(jié)核病最佳策略的重要一步是通過痰涂片顯微鏡檢查來識別可疑患者，在涂片中找到結(jié)核桿菌是確診結(jié)核的金標準[11]。醫(yī)學(xué)實驗室認可和各級醫(yī)院評審都對抗酸染色提出要進行室內(nèi)質(zhì)控和參加EQA的要求。為了加強標本抗酸染色顯微鏡鏡檢的準確性，促進實驗室內(nèi)部人員結(jié)果的一致性，重慶市臨床檢驗中心于2017年在全國較早地開展了抗酸染色顯微鏡檢查EQA。目前抗酸染色EQA包括實驗室現(xiàn)場評價、盲法復(fù)檢以及批量測試。現(xiàn)場評價的優(yōu)點是能直接觀察實驗室實際工作，能核實并驗證設(shè)備和耗材，因此有利于發(fā)現(xiàn)問題；缺點是工作時間短，工作強度大，而且花費高。盲法復(fù)檢是組織者現(xiàn)場抽取實驗室保存的陽性和陰性標本片子送到另一個實驗室顯微鏡檢查，這種方式可評估顯微鏡檢查結(jié)果，但不能更好地評估實驗室染色過程。本中心自制抗酸染色涂片標本，以批量測試方式發(fā)放到參與實驗室，可以發(fā)現(xiàn)抗酸染色過程和顯微鏡檢查方面存在的問題。

隨著實驗室建設(shè)規(guī)范化及質(zhì)控意識日益增強，本市各級醫(yī)學(xué)實驗室積極參加EQA，由2017年最初的58家增加至2019年的88家實驗室，綜合三級醫(yī)院由17家增加至24家，綜合二級醫(yī)院由21家增加至35家，中醫(yī)系統(tǒng)實驗室由14家增加至20家，民營醫(yī)院由3家增加至6家。經(jīng)過5次EQA項目的開展，實驗室總合格率從96.6%上升至97.7%，抗酸染色顯微鏡檢查正確率明顯提高，這也正是抗酸染色顯微鏡檢查EQA開展的目的體現(xiàn)。

2017-2019年共發(fā)放涂片標本1 930張，陽性標本符合率為98.1%，陰性標本符合率為97.8%，總符合率97.9%。在埃塞俄比亞南部，SHARGIE等[12]進行了一項盲目復(fù)查研究，結(jié)果顯示總體錯誤為3.2%，總符合率為96.8%。本市抗酸染色鏡檢總符合率稍高于此文獻報道。

201814號標本有9家實驗室發(fā)生了HFN結(jié)果，是符合率最低的標本。本中心對此進行了調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，本次發(fā)放的5個標本中201814號標本制備時標本性質(zhì)不如其他4個標本黏稠，該標本更容易脫色，造成有些實驗室染色呈陰性。這提醒實驗室抗酸染色時由于標本性質(zhì)的不同，具體脫色時間應(yīng)根據(jù)標本情況決定，否則易產(chǎn)生假陽性或假陰性。201913號標本5家實驗室報告了LFP，實驗室忽略了陰性片子的質(zhì)控。報告假陽性和假陰性結(jié)果都是重大的錯誤，本市室間質(zhì)評項目總錯誤率為2.1%，陰性標本檢測回報結(jié)果假陽性率達到2.2%。MOSISSA等[13]報道不染色標本有1.6%假陽性率，比本市實驗室自己染色標本假陽性低。假陽性結(jié)果會造成嚴重后果，會因誤診而對病人造成傷害，增加社會成本，并導(dǎo)致對實驗室提供的服務(wù)失去信心。假陽性結(jié)果可能與實驗室專業(yè)人員培訓(xùn)水平有關(guān)，如染色技術(shù)、實驗室人員顯微鏡檢查技術(shù)、批量測試等因素引起。假陽性結(jié)果預(yù)防措施：注意染色質(zhì)量問題，染液結(jié)晶會誤認成抗酸桿菌；染色時玻片保持一定距離，相互徹底分開，避免菌漂移污染；染色時勿使玻片染液干燥；染色時標本按一定順序擺放；保證染色完畢標本標簽完整可視。

本市室間質(zhì)評項目陽性標本檢測回報結(jié)果假陰性率為1.9%，MOSISSA等[13]研究報道假陰性率高達9.7%，AYANA等[14]研究報道假陰性率高達15.0%，遠遠高于本市結(jié)果。這與MOSISSA研究標本數(shù)為32個，AYANA研究標本數(shù)為80個，都遠遠低于本市標本數(shù)有關(guān)。假陰性結(jié)果患者可能不會接受治療，從而導(dǎo)致進一步的社區(qū)傳播和結(jié)核病的防控失敗。通過將上報假陰性結(jié)果的標本回收發(fā)現(xiàn)，由于標本脫色過度，造成假陰性。假陰性結(jié)果預(yù)防措施：先閱讀室內(nèi)質(zhì)控片是否在控；報告陰性前，閱片滿足300個視野。

本市QE率高達5.4%，QE反映大家在閱片時存在一個以上數(shù)量差異，這個數(shù)據(jù)低于MOSISSA等[13]報道的不染色標本的11.6%。造成QE原因有染色時加熱不充分，未能使抗酸桿菌充分著色；觀察涂片視野數(shù)量不足；陽性涂片的分級報告標準掌握差。這需要加強人員培訓(xùn)和實驗室間比對，逐步實現(xiàn)結(jié)果一致性。

抗酸染色顯微鏡檢查對染色過程和顯微鏡鏡檢都有要求。目前本市實驗室抗酸染色使用染片儀有3家，絕大多數(shù)都是人工進行染色。針對人工染色，更需要做好室內(nèi)質(zhì)控，保證試劑的有效性和人員操作的正確性。顯微鏡鏡檢與一般檢測不同，要求人員具有豐富的形態(tài)學(xué)工作經(jīng)驗，具備一定的臨床知識和綜合分析能力。在實際工作中，由于標本性質(zhì)、細菌本身對染液的親和力以及細菌受到藥物影響后形態(tài)的變異等，往往給實驗室鏡檢人員對細菌的認知帶來很大的困難，這要靠培訓(xùn)和實踐經(jīng)驗來提高對細菌辨識能力[15]。

EQA可發(fā)現(xiàn)和糾正常規(guī)工作中的問題。通過自制標本開展抗酸染色顯微鏡檢查EQA工作，實驗室對抗酸染色顯微鏡檢查質(zhì)量控制越來越重視，抗酸染色顯微鏡檢查質(zhì)量有明顯改進，推動了抗酸染色顯微鏡檢查結(jié)果的準確性、可比性，為臨床診療提供快速可靠的依據(jù)，為結(jié)核病控制發(fā)揮積極作用。