lncRNA NNT-AS1和miR-424在子宮內膜癌組織中的表達及其臨床意義

馬宇光,昝 瑛,王 夢,高 瀟,趙 芳,張淑群

西安交通大學第二附屬醫院腫瘤科,陜西西安 710004

子宮內膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，2017年有6.2萬例左右新診斷病例[1-2]。有研究報道，長鏈非編碼RNA煙酰胺核苷酸轉氫酶反義RNA1(lncRNA NNT-AS1)在多種惡性腫瘤中表達上調[3-5]，且lncRNA NNT-AS1可以與微小RNA-424(miR-424)結合促進胃癌的發生和周期進展[6]。miR-424是腫瘤相關miRNA[7]，在不同惡性腫瘤中可發揮促癌或抑癌作用[8-10]，而在子宮內膜癌中miR-424低表達可抑制腫瘤細胞侵襲和克隆球形成[11]。本研究旨在探討lncRNA NNT-AS1和miR-424在子宮內膜癌組織中的表達及臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年2月至2014年10月在本院行手術切除的60例子宮內膜癌患者的子宮內膜癌新鮮組織為研究材料。納入標準：(1)患者首次行手術切除；(2)切除組織經病理專家證實為子宮內膜癌；(3)患者未經任何形式的腫瘤治療；(4)具有完整的臨床病理和隨訪資料。排除標準：(1)子宮內膜癌遠處轉移者；(2)合并其他器官腫瘤者；(3)合并心、肝、腎等重要臟器嚴重功能障礙者。子宮內膜癌患者年齡38～76歲，平均(56.81±10.44)歲；組織病理類型為子宮內膜樣42例，非子宮內膜樣18例；國際婦產科聯盟(FIGO)分期，Ⅰ期19例，Ⅱ期16例，Ⅲ期15例，Ⅳ期10例；肌層浸潤程度，<1/2肌層39例，≥1/2肌層21例；病理分級，G1 31例，G2 20例，G3 9例；脈管浸潤28例，無脈管浸潤32例；淋巴結轉移43例，無淋巴結轉移17例。另選取同期因子宮其他疾病行子宮切除的40例患者的新鮮正常子宮內膜組織作為研究材料。子宮其他疾病患者年齡40～72歲，平均(55.89±11.25)歲。2組患者年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究符合赫爾本宣言，并經本院倫理委員會批準，患者和其家屬均簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器 Trizol試劑來自北京天漠科技開發有限公司；研缽來自江蘇順和教學儀器有限公司；三氯甲烷、異丙醇和無水乙醇來自天津市風船化學試劑科技有限公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)水，lncRNA NNT-AS1、miR-424和內參U6引物來自生工生物工程上海(股份)有限公司；反轉錄試劑盒來自美國Fermentas公司；實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈反應(q-PCR)試劑盒來自美國Invitrogen公司；NanoDrop2000來自美國Thermo公司；7500 PCR儀來自美國Bio-Rad公司。

1.3q-PCR檢測 取手術切除的新鮮組織立即凍于液氮中，放于研缽中研為粉末后移至EP管中，在管中加入1 mL Trizol試劑裂解，加入200 μL三氯甲烷混勻后4 ℃靜置5 min，12 000 r/min離心30 min，獲取上層水相溶液與等體積的異丙醇混勻后4 ℃、12 000 r/min離心30 min，棄掉液體，加入無水乙醇4 ℃、12 000 r/min離心30 min，DEPC水溶解RNA，NanoDrop2000測得RNA純度(A260/A280=2.0左右)和水平。按照反轉錄試劑盒說明書配制反應體系：含MgCl21 μL的10%DNaseⅠ反應緩沖液1 μL，總RNA 1.0 μg，RNase自由H2O 1～9 μL，總體積為10 μL，37 ℃ 30 min將RNA逆轉為cDNA。以cDNA為模板，按照q-PCR試劑盒說明書配制反應體系，Platinum?含有ROX的定量PCR SuperMix-UDG 25 μL、引物F 1 μL、引物R 1 μL、熒光探針1 μL、cDNA模板5 μL、ddH2O 17 μL，總體積50 μL。擴增反應條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，45個循環(95 ℃ 15 min，60 ℃ 30 s)。7500 PCR儀上機檢測各樣品的循環閾值(Ct)。采用2-ΔΔCt公式以U6基因為內參，計算lncRNA NNT-AS1和miR-424的相對表達水平。引物序列如下：

lncRNA NNT-AS1引物F：5′-AGTTCCACCAAGTTTCTTCA-3′,R：5′-AGGTTTTGCCAGCATAGAC-3′；miR-424引物F：5′-CCAGCAGTTCAAAACATGAATTG-3′,R：5′-TATGGTTGTTCTCGACTCCTTGAC-3′；內參U6引物F：5′-CGTTTTACTTCCTCATACAGCAC-3′,R′5′-GCA-CCAAGAGACCTGTGACA-3′。

1.4隨訪 采用電話詢問或者門診查詢的方式對子宮內膜癌患者進行隨訪，時間為3個月隨訪1次，計算患者手術后5年生存率。

2 結 果

2.1不同子宮內膜組織中lncRNA NNT-AS1和miR-424的相對表達水平比較 子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1相對表達水平(1.70±0.31)高于正常子宮內膜組織(1.04±0.33)，而miR-424相對表達水平(0.71±0.24)則低于正常子宮內膜組織(0.97±0.21)，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同子宮內膜組織中lncRNA NNT-AS1和miR-424的相對表達水平

2.2子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1、miR-424相對表達水平與臨床病理特征的關系 子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1相對表達水平與患者的年齡、組織病理類型、肌層浸潤程度和病理分級無關(P>0.05)，與FIGO分期、脈管浸潤和淋巴結轉移有關(P<0.05)；子宮內膜癌組織中miR-424相對表達水平與患者年齡、組織病理類型和病理分級無關(P>0.05)，與FIGO分期、肌層浸潤程度、脈管浸潤和淋巴結轉移有關(P<0.05)。見表1。

表1 子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1和miR-424相對表達水平與臨床病理特征的關系

2.3子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1、miR-424相對表達水平對患者預后的影響 60例子宮內膜癌患者隨訪結果顯示，死亡34例，存活26例，5年生存率為43.33%。

根據子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1、miR-424的相對表達水平將患者分為lncRNA NNT-AS1高表達組(>1.70，26例)、lncRNA NNT-AS1低表達組(≤1.70，34例)和miR-424高表達組(>0.71，33例)和miR-424低表達組(≤0.71，27例)。lncRNA NNT-AS1高表達組死亡17例，存活9例，5年生存率為34.62%；lncRNA NNT-AS1低表達組死亡17例，存活17例，5年生存率為50.00%；miR-424高表達組死亡18例，存活15例，5年生存率為45.45%，miR-424低表達組死亡16例，存活11例，5年生存率為40.74%。見表2。

表2 子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1、miR-424相對表達水平對患者預后的影響

分別繪制lncRNA NNT-AS1和miR-424高、低表達組的Kaplan-Meier生存曲線，采用Log-Rank檢驗分析顯示，lncRNA NNT-AS1高表達組患者的預后比lncRNA NNT-AS1低表達組差(P<0.05)，而miR-424高表達組患者的預后則比miR-424低表達組好(P<0.05)。見圖2。

圖2 lncRNA NNT-AS1與miR-424高、低表達子宮內膜癌患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4單因素和多因素Cox回歸分析子宮內膜癌患者預后不良的影響因素 建立COX比例回歸模型，以本研究資料為樣本，以預后狀況為應變量，賦值1=死亡，0=生存，t=生存期。分別采用單因素和多因素COX回歸分析可能影響子宮內膜癌患者預后不良的影響因素，結果顯示，FIGO分期為晚期、有淋巴結轉移、lncRNA NNT-AS1高表達和miR-424低表達是子宮內膜癌患者預后不良的影響因素(P<0.05)，見表3。

表3 Cox回歸分析子宮內膜癌患者預后不良的影響因素

2.5子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1相對表達水平與miR-424的相關性 Pearson分析顯示，子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1相對表達水平與miR-424呈負相關(r=-0.368，P<0.05)，見圖3。

圖3 子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1相對表達水平與miR-424的相關性

3 討 論

子宮內膜癌是全球女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，具有高發病率和病死率。近年來，由于肥胖癥和代謝性疾病的發病率增加，子宮內膜癌發病率和病死率呈逐年增加的趨勢，且發病年齡趨于年輕化，嚴重威脅女性患者的生命健康[12-13]。子宮內膜癌患者早期癥狀為不規則陰道流血，容易被患者忽視，由于子宮內膜癌具有高度侵襲性，故診斷時患者已出現腫瘤侵襲和轉移，進展為腫瘤晚期[14]。目前子宮內膜癌患者的治療主要包括手術、化療、放療和內分泌治療，早期患者較晚期患者的療效較好，但對晚期和復發子宮內膜癌患者的治療目前仍然是個難題[15]。分子靶向治療是新近研究的晚期腫瘤重要的新型治療手段，有研究報道，布立尼布和吉非替尼等一些分子靶向藥物對晚期子宮內膜癌患者具有一定的療效，但是總體臨床反應率較低[16]，因此，探尋特異性的新型治療靶點對子宮內膜癌患者的治療至關重要。

人類基因組包含非編碼DNA，其產物非編碼RNA(ncRNA)是可以影響基因調控和腫瘤細胞惡性行為的關鍵因子，包括長鏈非編碼RNA(lncRNA)和miRNA。lncRNA是一組長度超過200個核苷酸的RNA，由于缺乏開放閱讀框，不能翻譯成蛋白質，但它們可以通過轉錄或轉錄后調控來調節多種病理和生理過程[17]。lncRNA由于與腫瘤發生發展密切相關而受到廣泛的關注，其在腫瘤增殖、侵襲、轉移和放化療耐藥等生物學行為中發揮重要作用[18]。lncRNA NNT-AS1位于帶有3個外顯子的人類染色體5p12上，是新型的腫瘤相關lncRNA。lncRNA NNT-AS1在非小細胞肺癌和膀胱癌中表達增加，沉默lncRNA NNT-AS1的表達，均可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲能力和上皮間質轉化[3-4]，但有文獻報道在胃癌組織中lncRNA NNT-AS1表達下降，并且lncRNA NNT-AS1的低表達與原發腫瘤的位置和淋巴/血管浸潤有關[19]。由此可見，lncRNA NNT-AS1在不同腫瘤中發揮不同的作用，但是其在子宮內膜癌組織中的表達情況未知。本研究發現，子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1的相對表達水平明顯高于正常子宮內膜組織，并與患者的FIGO分期、脈管浸潤和淋巴結轉移相關(P<0.05)。

有研究報道，miR-424在不同的腫瘤中發揮不同的作用，甚至是相反的，在喉鱗狀細胞癌和結直腸癌等惡性腫瘤中miR-424表達上調，促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲和黏附，并影響細胞周期進程[7-8]。在肝細胞癌中miR-424表達下調，并與甲胎蛋白、TNM分期、肝內轉移和肝癌總生存期差有關，miR-424在體內和體外均抑制細胞增殖和侵襲能力[10]。DONG等[11]報道，miR-424表達降低與子宮內膜癌患者預后較差有關，并降低腫瘤細胞侵襲和腫瘤球形成能力。ZHENG等[20]報道，miR-424表達降低與子宮內膜癌患者臨床腫瘤分期、細胞分化、淋巴結轉移和細胞遷移能力有關，miR-424抑制腫瘤細胞侵襲和遷移能力。本研究發現，子宮內膜癌組織中miR-424的相對表達水平明顯低于正常子宮內膜組織，并與患者的病理分期、肌層浸潤程度、脈管浸潤和淋巴結轉移相關(P<0.05)。

最近研究表明，lncRNA可以作為競爭性內源RNA(ceRNA)，與miRNA競爭性相互作用，從而使miRNA遠離其靶標mRNA，阻止miRNA發揮調控作用[5]。CHEN等[6]報道，lncRNA NNT-AS1與miR-424結合，通過抑制其表達，在胃癌中發揮促癌基因的作用。Pearson相關分析顯示，子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1相對表達水平與miR-424呈負相關(r=-0.368,P<0.05)，表明lncRNA NNT-AS1在子宮內膜癌中可能通過miR-424發揮作用，但具體的作用機制還有待基礎實驗進行研究。進一步單因素和多因素Cox回歸分析發現，病理分期晚期、有淋巴結轉移、lncRNA NNT-AS1高表達和miR-424低表達是影響子宮內膜癌患者預后不良的危險因素(P<0.05)，且生存分析發現，lncRNA NNT-AS1高表達和miR-424低表達的患者生存情況較差，提示二者與患者的預后密切相關。

綜上所述，子宮內膜癌組織中lncRNA NNT-AS1呈高表達，miR-424呈低表達，二者的相對表達水平呈負相關，lncRNA NNT-AS1可能通過miR-424發揮作用。lncRNA NNT-AS1和miR-424是子宮內膜癌患者預后不良的影響因素，lncRNA NNT-AS1/miR-424軸可能是子宮內膜癌潛在的治療靶點。