血漿miR-107-5p、miR-210水平與膿毒癥并發急性腎損傷患者腎功能、炎癥指標及預后的關系*

鄭源任，李云婷，馮奇桃，李詩陽，林芳崇

海南醫學院第二附屬醫院急診科,海南海口 570000

膿毒癥是感染引起的全身炎性反應綜合征，可導致危及生命的器官功能障礙，腎是最易受累器官之一，膿毒癥“細胞因子風暴”可引起急性腎損傷(AKI)和死亡[1]。早期預測膿毒癥并發AKI具有重要意義，微小RNA(miR)是具有基因轉錄、蛋白質合成調控的內源性非編碼RNA，在維持體內平衡中具有重要作用，其表達異常與多種疾病的發生、發展有關。現有研究發現，miR在AKI中表達異常，對AKI診斷、預后預測具有潛在作用[2]。缺血再灌注損傷是引起AKI的主要原因，急性腎小管壞死或細胞凋亡是AKI的主要病理基礎，miR-107-5p參與腎小管內皮細胞增殖、凋亡調控機制[3]。miR-210是缺血調控關鍵因子，參與腎臟缺血再灌注損傷過程，在AKI患者血漿中水平上調，與AKI臨床分期明顯相關[4]。本研究檢測膿毒癥患者血漿miR-107-5p、miR-210水平，探討其與膿毒癥并發AKI腎功能、炎癥指標以及預后的關系，旨在為臨床診治、預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年5月至2020年3月我院重癥監護病房(ICU)收治的210例膿毒癥患者作為研究對象。納入標準：(1)膿毒癥診斷參考歐洲危重病醫學會制訂的膿毒癥診斷標準[5]；(2)年齡18～70歲；(3)既往無膿毒癥病史。排除標準：(1)血液系統、免疫系統疾病患者；(2)既往有腎病綜合征、腎小球腎炎、腎癌等原發性腎臟疾病病史患者；(3)入住ICU后48 h內死亡者。采集患者入院24 h內的一般人口學資料(年齡、性別)、體質量指數(BMI)、基礎疾病、感染部位、膿毒癥分級(膿毒癥、膿毒癥休克[6])、床旁監護儀記錄的入院24 h平均動脈壓(MAP)及平均心率(HR)。其中男118例，女92例；年齡18～70歲，平均(51.03±4.02)歲；膿毒癥146例，膿毒癥休克64例。根據是否并發AKI將210例患者分為AKI組(86例)和NAKI組(124例)。AKI患者符合診斷標準[7]:48 h內血肌酐(Scr)升高≥26.5 μmol/L；7 d內Scr升至≥1.5倍基線值；連續6 h尿量<0.5 mL/(kg·h)；排除系統紅斑狼瘡、創傷、大手術后等其它因素引起的腎損傷。AKI組和NAKI組臨床基本資料比較，年齡、膿毒癥分級比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而性別、BMI、基礎疾病、感染部位、MAP、HR比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。本研究獲得本院倫理委員會批準。患者家屬均知情同意并簽署同意書，診療期間保障患者隱私和安全。

1.2方法

1.2.1急性生理與慢性健康狀況評價Ⅱ(APACHEⅡ)評分 APACHEⅡ評分根據患者入ICU 24 h內臨床指標(體溫、HR、呼吸、MAP、血氧分壓、電解質、肌酐、白細胞計數、神經功能等)最差值計算[8]。

1.2.2腎功能、炎癥指標及miR-107-5p、miR-210水平檢測 于入院24 h內采集外周靜脈血6 mL，平均分裝于干燥試管和EDTA抗凝管，干燥試管標本用于檢測腎功能和炎癥指標，EDTA抗凝管標本用于檢測血漿miR-107-5p、miR-210相對水平。血標本均以離心半徑10 cm，3 000 r/min離心10 min，分離血清、血漿-80 ℃保存于超低溫冰箱。采用AU400全自動生化分析儀(日本Olympus公司)檢測血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)水平。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗在Model 550酶標儀(美國伯樂生命醫學產品公司)上檢測血清胱抑素C(Cys-C)、C反應蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)水平，試劑盒購自上海藍基生物科技有限公司。

采用實時熒光定量PCR檢測miR-107-5p、miR-210水平，方法如下：取血漿標本加入Trizol(美國Invitrogen公司)充分混勻，提取總RNA，使用ND-1000紫外分光光度計(美國NanoDrop公司)檢測RNA純度和完整性，選擇A260/A280比值為1.8～2.0的RNA樣品，而后按照試劑盒說明加入M-MLV反轉錄酶(Epicentre公司)將其轉錄為cDNA。CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)檢測miR-107-5p、miR-210水平。引物合成及序列測定由上海基康公司完成，序列如下：miR-107-5p上游引物為5′-GGAGCAGCATTGTACAGG-3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGA-3′；miR-210上游引物為5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游引物為5′-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3′。以U6為內參，U6上游引物為5′-AGAGAAGATTAGCATGGACCCTG-3′，下游引物為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。反應條件：95 ℃變性15 s，65 ℃退火20 s；75 ℃延伸15 s，共40個循環。以U6 snRNA 為內參，2-ΔΔCt計算各組的miR-107-5p、miR-210相對水平，共做3次平行試驗，取平均值，其中ΔΔCtmiR-107-5p=ΔCtmiR-107-5p-ΔCtU6 snRNA，ΔΔCtmiR-210=ΔCtmiR-210-ΔCtU6 snRNA。

表1 AKI組與NAKI組臨床基本資料

組別n感染部位[n(%)]泌尿系統導管相關血流感染腹腔感染其他膿毒癥分級[n(%)]膿毒癥膿毒癥休克MAP(x±s,mm Hg)HR(x±s,次/分)AKI組8623(26.74)29(33.72)21(24.42)13(15.12)51(59.30)35(40.70)102.35±6.3593.35±7.18NAKI組12437(29.84)40(32.26)35(28.23)12(9.68)95(76.61)29(23.39)103.24±6.4292.76±7.09t/χ21.7417.1820.9930.590P0.6280.0070.3220.556

1.2.3隨訪 統計膿毒癥并發AKI患者入院28 d內存活情況，將存活患者歸為存活組，死亡患者歸為死亡組。

2 結 果

2.1AKI組與NAKI組APACHEⅡ評分及miR-107-5p、miR-210、腎功能指標、炎癥指標水平比較 AKI組APACHEⅡ評分，以及miR-107-5p、miR-210、BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT水平均高于NAKI組(P<0.05)，見表2。

表2 AKI組與NAKI組APACHEⅡ評分及miR-107-5p、miR-210、腎功能指標、炎癥指標水平比較

2.2AKI組miR-107-5p、miR-210水平與腎功能指標、炎癥指標相關性 AKI組miR-107-5p、miR-210水平與BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT呈正相關(P<0.05)，見表3。

表3 miR-107-5p、miR-210水平與腎功能指標、炎癥指標的相關性

2.3不同預后膿毒癥并發AKI患者的miR-107-5p、miR-210、腎功能指標、炎癥指標水平比較 根據患者入院28 d內預后情況，將86例膿毒癥并發AKI患者分為死亡組和存活組，其中死亡組33例(38.37%)，死亡組53例(61.63%)。死亡組的miR-107-5p、miR-210、BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT水平高于存活組(P<0.05)，見表4。

表4 不同預后膿毒癥并發AKI患者miR-107-5p、miR-210、腎功能指標、炎癥指標水平比較

2.4影響膿毒癥并發AKI患者預后的因素 以膿毒癥并發AKI患者28 d存活情況為因變量(賦值：0=存活，1=死亡)，以年齡、性別(賦值：0=女，1=男)、基礎疾病(賦值：0=糖尿病，1=高血壓，2=冠心病，3=高脂血癥)、感染部位(賦值：0=泌尿系統，1=導管相關血流感染，2=腹腔感染，3=其他)、膿毒癥分級(賦值：0=膿毒癥，1=膿毒癥休克)、MAP、HR、APACHEⅡ評分、miR-107-5p、miR-210、BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT為自變量，建立Cox比例危險模型。單因素Cox比例回歸分析顯示，BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT、APACHEⅡ評分、miR-107-5p、miR-210與膿毒癥并發AKI患者預后有關(P<0.05)，見表5。多因素Cox比例回歸分析顯示，Cys-C、miR-210、miR-107-5p是膿毒癥并發AKI患者死亡的危險因素(P<0.05)，見表6。

表5 影響膿毒癥并發急性腎損傷患者預后的單因素Cox比例回歸分析

表6 影響膿毒癥并發急性腎損傷患者預后的多因素Cox比例回歸分析

2.5miR-107-5p、miR-210對膿毒癥并發AKI患者預后的預測效能 繪制miR-107-5p、miR-210預測膿毒癥并發AKI患者預后的ROC曲線，結果顯示，當miR-107-5p、miR-210的最佳臨界值為6.91、7.03時，二者預測膿毒癥并發AKI患者預后的AUC為0.878(95%CI：0.798～0.959)、0.814(95%CI：0.717～0.912)，靈敏度為81.82%、84.85%，特異度為84.91%、81.13%，約登指數為0.67、0.66，見圖1。

圖1 miR-107-5p、miR-210預測膿毒癥并發AKI患者預后的ROC曲線

3 討 論

膿毒癥是一種常見的致命疾病，AKI是膿毒癥最常見的并發癥之一，膿毒癥并發AKI的病理生理機制尚不清楚，可能與腎小管上皮細胞氧化應激、微血管功能障礙、炎性反應以及對炎癥損傷的代謝反應等有關。膿毒癥患者病死率與器官功能障礙有關，并發AKI可使膿毒癥患者病死率增加6-8倍[9]。目前缺乏預測膿毒癥患者并發AKI的靈敏度和特異度高的指標，導致AKI錯過最佳診治時機。miR主要通過與mRNA的3′-非翻譯區結合來調節細胞功能，組織特異性強，半衰期長，可穩定存在于外周血液中，逐漸成為疾病診斷、預后判斷的無創生物學指標[10]。

miR-107-5p是miR-107家族成員之一，在人類心臟、骨骼肌、大腦、肺、肝、腎、脾和胎盤中廣泛而穩定表達，在細胞對缺血應激反應、細胞代謝、細胞周期調控、組織損傷修復中發揮重要作用[11]。既往研究顯示，miR-107-5p異常表達與缺血性腦梗死[11]、肥胖[12]、腫瘤[13]和腎臟疾病的發生、發展[14]有關。本研究發現，AKI組miR-107-5p水平較NAKI組升高(P<0.05)，說明miR-107-5p可能參與了膿毒癥并發AKI發病過程，這是因為感染引起的腎血流量減少是膿毒癥并發AKI的主要病理基礎，內皮細胞的激活在膿毒癥并發AKI中起關鍵作用，膿毒癥期間病原菌刺激內皮細胞分泌大量炎癥因子，引起腎小管細胞損傷[15]。BUN、Scr、Cys-C是腎損傷診斷的重要指標，Cys-C可敏感反映腎小球濾過率。相關性分析結果顯示，miR-107-5p水平與BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT呈正相關(r=0.619、0.535、0.785、0.542、0.553,P<0.05)，說明miR-107-5p可能在膿毒癥患者炎性反應、腎損傷中發揮調控作用，參與AKI發病過程。可能的機制為miR-107-5p靶向內皮細胞中雙重特異性磷酸酶7，促使紋狀體細胞外信號調節激酶磷酸化，誘導腫瘤壞死因子-α分泌，進而介導腎小管上皮細胞收縮、E-鈣黏蛋白分泌減少、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶釋放和腎小管細胞損傷凋亡，導致Scr水平升高，腎損傷加重[3]。miR-107-5p還可靶向核糖體蛋白S19，抑制核糖體蛋白S19表達，抑制腎小管上皮細胞增殖，促使其凋亡[16]。

miR-210是重要的缺氧誘導基因，位于人類11p15.5染色體，受缺氧調控因子(HIF)1α、HIF2α調控，缺氧轉錄因子核因子-κB也可與miR-210結合，誘導miR-210表達[17]。miR-210具有調控細胞周期、促使干細胞存活、抑制線粒體代謝、促使細胞分化、誘導血管生成等作用[17]。近期研究發現，miR-210在腎損傷中表達異常，參與腎臟缺血再灌注損傷過程[18]。本研究發現，miR-210在AKI組中水平明顯升高，與LORENZEN等[19]報道結果一致；相關性分析結果顯示，miR-210與BUN、Scr、Cys-C、CRP、PCT呈正相關(r=0.596、0.632、0.705、0.512、0.547,P<0.05)，提示miR-210參與膿毒癥患者腎損傷過程。miR-210參與膿毒癥并發AKI的機制可能為膿毒癥患者伴隨的炎性反應影響了腎臟局部血流動力學，引發腎臟缺血再灌注損傷，導致腎臟局部缺氧，刺激HIF表達，miR-210作為HIF靶基因和靶分子，在HIF過度活化下表達明顯上調[18]。miR-210過表達可發揮負向調控HIF作用，通過靶向腎小管內皮細胞中HIF-1抑制因子mRNA 3′UTR，直接抑制HIF-1表達及其介導的細胞凋亡通路，進而降低腎臟缺氧性損傷[20]。

本研究發現，miR-210、miR-107-5p在膿毒癥并發AKI患者死亡組中的水平高于存活組，Cox回歸分析結果顯示，miR-210、miR-107-5p是膿毒癥并發AKI患者死亡的危險因素(OR=2.149、2.115,P<0.05)，說明miR-210、miR-107-5p水平增高可能預示著不良臨床結局的發生，miR-210、miR-107-5p可以為預測膿毒癥并發AKI患者的預后提供有價值的信息。ROC曲線分析miR-210、miR-107-5p預測膿毒癥并發AKI患者預后的AUC為0.878(95%CI：0.798～0.959)、0.814(95%CI：0.717～0.912)，靈敏度和特異度均在80%以上，證實miR-210、miR-107-5p對膿毒癥并發AKI患者的預后有預測價值，同時提示對于miR-210、miR-107-5p水平升高的膿毒癥并發AKI患者應高度警惕不良臨床結局的發生。LORENZEN等[19]報道miR-210是膿毒癥并發AKI患者28 d死亡的獨立預測因子。本研究回歸分析同樣顯示，Cys-C與膿毒癥并發AKI患者28 d生存狀況有關，Cys-C是慢性腎衰竭、AKI診斷的敏感指標，可用于預測AKI患者的死亡風險[21]。

綜上所述，膿毒癥并發AKI患者血漿miR-107-5p、miR-210水平較未并發AKI患者明顯增高，二者水平升高與腎損傷程度、炎性反應程度和不良預后相關，并有望成為膿毒癥并發AKI患者預后評估的潛在生物學標志物和臨床治療的新靶點。