急性缺血性腦卒中患者外周血NLRP3炎性小體表達(dá)變化及臨床意義*

蘇詩(shī)涵，婁方麗

解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，云南昆明 650032

根據(jù)最新的中國(guó)腦卒中防治報(bào)告顯示，腦卒中是造成我國(guó)居民致殘和死亡的主要原因之一，并且隨著我國(guó)人口老年化的進(jìn)展，其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[1]。其中，急性缺血性腦卒中(AIS)占據(jù)了所有腦卒中病例的80%，針對(duì)AIS的防治，顯得尤為重要[2]。近年來(lái)，相關(guān)研究顯示，機(jī)體炎性反應(yīng)的激活與放大是AIS發(fā)生與進(jìn)展的重要因素[3]，因此，抑制炎性反應(yīng)作為AIS免疫治療的手段之一，是臨床研究的重要方向。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎性小體及下游信號(hào)通路的激活是機(jī)體炎性反應(yīng)持續(xù)及放大的重要原因之一，該信號(hào)通路與眾多炎癥性疾病的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)，如自身免疫性疾病、惡性腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等[4-6]。有研究顯示，NLRP3炎性小體的激活可產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起組織細(xì)胞損傷及器官功能不全，主要信號(hào)通路包括促進(jìn)下游白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-18的合成與分泌，激活半胱氨酸蛋白酶1(Caspase-1)焦亡通路[7]。AIS的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體炎性反應(yīng)密切相關(guān)，而其體內(nèi)NLRP3炎性小體表達(dá)水平如何，目前少見(jiàn)報(bào)道，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2020年1月本院收治的185例AIS患者作為觀察組，并選擇同期門(mén)診體檢健康者50例為對(duì)照組。入選標(biāo)準(zhǔn)：所有觀察組患者均滿足AIS的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往已存在嚴(yán)重肝腎功能不全的患者；合并自身免疫系統(tǒng)疾病的患者；合并腦出血的患者；合并惡性腫瘤的患者。依據(jù)美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)對(duì)觀察組患者病情嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分，并根據(jù)評(píng)分結(jié)果將其分為3組，NIHSS評(píng)分≤4分為輕度組(59例)；NIHSS評(píng)分5～15分為中度組(62例)；NIHSS評(píng)分≥l6分為重度組(64例)。根據(jù)改良的Rankin量表(mRS)評(píng)分對(duì)患者臨床預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，將其分為預(yù)后良好組(143例)與預(yù)后不良組(42例)。觀察組185例中男102例、女83例，年齡56～78歲、平均(67.1±9.5)歲，體質(zhì)量指數(shù)19.0～26.4 kg/m2、平均(22.9±2.8)kg/m2，有吸煙史92例；對(duì)照組50例中男28例、女22例，年齡54～75歲、平均(65.8±8.9)歲，體質(zhì)量指數(shù)19.3～26.0 kg/m2、平均(22.6±3.0)kg/m2，有吸煙史24例。觀察組與對(duì)照組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。該研究征得了患者及家屬書(shū)面知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)NLRP3和Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的檢測(cè) 在一試管中加入2 mL人外周血淋巴細(xì)胞分離液，同時(shí)在EDTA抗凝管加入靜脈血2 mL。將靜脈血加入淋巴細(xì)胞分離液中，混勻后以3 000 r/min離心5 min，用毛細(xì)吸管吸出細(xì)胞，得到PBMCs。在各組PBMCs試管中加入1 mL Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)，提取總RNA，采用美國(guó)賽默飛公司Thermo Scientific NanoDrop One超微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定RNA水平。然后進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，其方法按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)賽默飛公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，依據(jù)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)(美國(guó)賽默飛公司)建立25 μL反應(yīng)體系，包括經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的水17.5 μL、10×Taq緩沖液2.5 μL、氯化鎂2.0 μL、脫氧核糖核苷三磷酸混合物0.5 μL、上下游引物各0.5 μL、Tap酶0.5 μL。反應(yīng)條件參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]。結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算相應(yīng)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2PBMCs NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè) 提取各組PBMCs總蛋白，測(cè)定蛋白水平。按參考文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行免疫印跡，檢測(cè)NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平。方法簡(jiǎn)述如下：取50 μg蛋白于電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗NLRP3抗體(1∶400)、Caspase-1抗體(1∶400)及抗GAPDH抗體(1∶500)過(guò)夜。次日孵育二抗(1∶10 000)，測(cè)定蛋白條帶灰度值，計(jì)算目的條帶與GAPDH灰度比值。

1.2.3外周血IL-1β和IL-18的檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)各組外周血IL-1β和IL-18水平，具體操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)(上海信帆生物公司)。簡(jiǎn)要步驟如下：取各組研究對(duì)象空腹靜脈血4 mL，制備樣品；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和空白孔，標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同濃度樣品，空白孔僅加入顯色液和終止液；經(jīng)室溫孵育、洗滌后，加入抗體工作液(每孔100 μL)、顯色液(每孔100 μL)、終止液(每孔50 μL)，最后測(cè)定各組A450值。

2 結(jié) 果

2.1觀察組與對(duì)照組PBMCs NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，觀察組PBMCs NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、圖2。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

注：A為免疫印跡檢測(cè)NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平，B為觀察組與對(duì)照組NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平柱狀圖；與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2不同嚴(yán)重程度AIS患者間PBMCs NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及IL-1β、IL-18水平比較 輕度組、中度組、重度組患者間PBMCs NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及IL-1β、IL-18水平比較，重度組最高，中度組次之，輕度組最低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同嚴(yán)重程度AIS患者間PBMCs NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及IL-1β、IL-18水平比較

2.3不同預(yù)后AIS患者間PBMCs NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及IL-1β、IL-18水平比較 預(yù)后不良組患者PBMCs NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及IL-1β、IL-18水平均高于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同預(yù)后AIS患者間NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及IL-1β、IL-18水平比較

2.4相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，AIS患者PBMCs NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與Caspase-1 mRNA、IL-1β、IL-18呈正相關(guān)(r=0.760，P<0.001；r=0.712，P<0.001；r=0.640，P=0.008)，也與NIHSS評(píng)分和mRS評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.730，P<0.001；r=0.690，P<0.001)。

2.5PBMCs NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、mRS和NIHSS評(píng)分對(duì)AIS患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值 ROC曲線分析顯示，PBMCs NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平、mRS和NIHSS評(píng)分預(yù)測(cè)AIS患者預(yù)后不良的AUC為0.894(95%CI0.821～0.967)、0.780(0.626～0.934)和0.783(0.708～0.858)，最佳臨界值為1.84、3.70分和14.20分，靈敏度為81.08%、78.57%和68.57%，特異度為82.50%、73.68%和73.42%。NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平預(yù)測(cè)AIS患者預(yù)后不良的效能優(yōu)于mRS、NIHSS評(píng)分的預(yù)測(cè)效能。見(jiàn)圖3、表3。

圖3 NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及mRS、NIHSS評(píng)分預(yù)測(cè)AIS患者預(yù)后不良的ROC曲線

表3 各指標(biāo)評(píng)估AIS患者預(yù)后不良的ROC曲線分析

3 討 論

隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加快，AIS已成為導(dǎo)致我國(guó)居民致死和致殘的重要疾病之一，并且發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。目前，對(duì)于AIS病情及預(yù)后的評(píng)估，臨床常采用NIHSS和mRS評(píng)分等，但該方法往往存在一定的滯后性。近年來(lái)，隨著相關(guān)研究的不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)的激活參與了AIS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。NLRP3炎性小體作為炎性反應(yīng)的重要啟動(dòng)因子，其與AIS患者病情及預(yù)后的關(guān)系如何，目前，少見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。

免疫炎性小體的激活是促進(jìn)下游炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的啟動(dòng)因子之一，在免疫炎性小體分類方面，NLRP3是重要成員之一，參與了天然免疫系統(tǒng)的構(gòu)建[11]。NLRP3在細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，研究較為廣泛而深入，它可激活下游Caspase-1/IL-1β及IL-18通路，是促進(jìn)炎性反應(yīng)的重要信號(hào)通路之一[12]。相關(guān)研究顯示，NLRP3相關(guān)通路的激活與炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)其可作為潛在的治療靶點(diǎn)[9]。本研究結(jié)果顯示，AIS患者機(jī)體NLRP3及相關(guān)下游信號(hào)通路呈激活狀態(tài)，主要表現(xiàn)為PBMCs NLRP3、Caspase-1 mRNA相對(duì)表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。隨著AIS患者病情的進(jìn)展，患者PBMCs NLRP3及相關(guān)下游信號(hào)通路進(jìn)行性升高或激活。為進(jìn)一步明確PBMCs NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與NIHSS評(píng)分及相關(guān)炎性細(xì)胞因子的關(guān)系，通過(guò)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示AIS患者PBMCs NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與NIHSS評(píng)分及下游炎性細(xì)胞因子水平呈正相關(guān)(P<0.05)，提示AIS患者外周血NLRP3炎性小體水平越高，其病情越危重。外周血NLRP3炎性小體水平升高引起AIS的發(fā)生、進(jìn)展，可能與多種因素相互作用有關(guān)。有研究證實(shí)，外周血NLRP3炎性小體可直接促進(jìn)低密度脂蛋白的氧化及脂質(zhì)的過(guò)氧化，引起氧自由基生成明顯增加，從而損傷內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致內(nèi)皮素及炎性因子的釋放，促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的形成，從而導(dǎo)致腦卒中的發(fā)生[13]。其次，外周血NLRP3炎性小體可激活體內(nèi)血小板，促進(jìn)血小板的黏附與聚集，導(dǎo)致血栓形成[14]。

為進(jìn)一步分析外周血NLRP3炎性小體與AIS患者預(yù)后的關(guān)系，將AIS患者分為預(yù)后良好組與預(yù)后不良組，分析這2組中PBMCs NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平的差異。本研究結(jié)果顯示，預(yù)后不良組PBMCs NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平高于預(yù)后良好組(P<0.05)，同時(shí)與mRS評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)，提示外周血NLRP3炎性小體水平可有效地反映AIS患者臨床預(yù)后，ROC曲線分析也顯示其對(duì)AIS患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)價(jià)值較高。對(duì)于炎癥性疾病的有效治療，是困擾臨床的重大問(wèn)題，所以抑制NLRP3及相關(guān)下游通路激活可能是相關(guān)新藥研究的重要方向[15]。

綜上所述，NLRP3炎性小體與AIS的病情進(jìn)展密切相關(guān)。通過(guò)檢測(cè)外周血NLRP3炎性小體表達(dá)水平，可有效地評(píng)估AIS患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后。但本研究也存在一定的局限性，由于AIS患者樣本量偏少，需要進(jìn)一步加大樣本量，采取多中心聯(lián)合的方式對(duì)外周血NLRP3炎性小體預(yù)測(cè)AIS患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的臨床價(jià)值做進(jìn)一步的研究。