SetDB1和P53在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及意義＊

文/梁家東，梁麗梅，黃炳臣，吳雪銘，王娟

結(jié)直腸癌是目前最常見的消化道惡性腫瘤之一，在全球惡性腫瘤死亡率中排在第四位[1]。SetDB1（set domain bifurcated 1）是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶中重要的結(jié)構(gòu)域之一，在組蛋白的甲基化中扮演了重要的角色。p53屬于抑癌基因，在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的過程中是由于原癌基因和抑癌基因突變所致的[1]。SetDB1在結(jié)直癌中如何通過調(diào)控H3K9me3，使p53對原癌基因失去抑癌作用的研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道，因此，本文通過免疫組織化學(xué)的方式, 研究結(jié)直腸癌SetDB1的表達(dá)與p53的表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)性以及其臨床病理特征，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2017年5月至2019年8月期間病理科診斷明確的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者癌組織及其距癌組織＞ 5 cm處的癌旁組織72例。其中男性49例，女性23例，年齡32-88歲，平均年齡為56.6±3.1歲。

納入條件：（1）所有病例都是經(jīng)本科室一名副主任病理醫(yī)生級別以上診斷明確的結(jié)直腸原發(fā)性腺癌。（2）所有病例都未經(jīng)過化療和放療。（3）所有病例都是外科醫(yī)生行根治術(shù)。（4）所有病例都經(jīng)患者及其家屬知情或簽署知情同意書。

排除條件：（1）病理醫(yī)生診斷為黏液腺癌。（2）雖是根治術(shù)，但腸系膜未找到15枚淋巴結(jié)以上的病例。（3）未取得患者及其家屬知情或簽署知情同意書的病例。

1.2 試劑材料

SetDB1 鼠抗人抗體購自Abcam公司，P53兔抗人抗體購自上海邁新公司；EDTA抗原修復(fù)液和DAB顯色試劑盒均從北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司購買；SA1022-SABC 試劑盒從武漢博士德生物有限公司購買。

1.3 免疫組化染色SP法

所有標(biāo)本都經(jīng)過常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋、蠟塊進(jìn)行3um厚連續(xù)切片、撈片、烤片處理,置于60℃烤箱中烤片過夜，后經(jīng)三缸二甲苯溶液及三缸等級濃度梯度的乙醇溶液中脫蠟至水洗，隨后嚴(yán)格按照免疫組化SP法說明書的步驟分別對SetDB1蛋白和P53蛋白進(jìn)行檢測。DAB顯色，顯微鏡下控制顯色，用自來水沖洗，終止顯色。進(jìn)行蘇木精復(fù)染，分化，返藍(lán) ，脫水，透明，封片后鏡檢。利用PBS 液代替一抗作為陰性對照，用已知的陽性切片作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

由本科室兩位主治級別以上病理醫(yī)生各自獨(dú)立根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率進(jìn)行綜合判定。染色強(qiáng)度：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞百分率：陽性細(xì)胞率 ≤10%為0分，陽性細(xì)胞率 11%～50%為1分 ，陽性細(xì)胞率51%～75%為2分 ，陽性細(xì)胞率≥76%為3分。兩項(xiàng)評分之積為基因表達(dá)情況：0分為陰性，1～2分為弱陽性，3～4分為陽性，≥5分為強(qiáng)陽性[2]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

相關(guān)數(shù)據(jù)運(yùn)用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。采用兩兩比較卡方檢驗(yàn)或等級資料Mann-Whitney 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)資料，采用秩和檢驗(yàn)分析兩者相關(guān)性，P ＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SetDB1蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與癌組織浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

結(jié)直腸癌組織中SetDB1蛋白陽性表達(dá)率為77.78%，明顯高于癌旁組織SetDB1蛋白陽性表達(dá)率 30.56%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2＝ 9.051，P ＜ 0.05）。

在72例癌組織中有44例侵及肌全層，SetDB1陽性表達(dá)率為86.36%，在28例未侵及肌全層中，SetDB1陽性表達(dá)為64.29%，差異顯著（x2=4.826，p＜0.05）；這表明SetDB1的陽性表達(dá)可能參與腫瘤的浸潤生物學(xué)行為。在50例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中SetDB1的陽性表達(dá)率為86.00%，而在22例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中Set1 DB1的陽性表達(dá)率為59.10%，差異顯著（x2＝6.401，P ＜0.05）。這提示Set1 DB1 的陽性表達(dá)可能參與腫瘤的轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為。

2.2 P53在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

結(jié)直腸癌的癌灶、癌旁組織中P53的陽性表達(dá)率分別為59.72%、11.11%，前者明顯高于后者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2＝ 6.070，P＜0.05）；50例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中，p53陽性表達(dá)率為68.00%，22例淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者中，p53陽性表達(dá)率為40.91%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2＝4.661，P ＜0.05），這提示p53的陽性表達(dá)可能參與腫瘤的轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為。

2.3 SetDB1與P53相關(guān)性分析

癌組織中 SetDB1 與P53 均可呈高表達(dá)，且 SetDB1 與 P53陽性表達(dá)存在正相關(guān)性（OR＝0.515，p＜0.05），見表1。

3 討論

多基因協(xié)同作用參與結(jié)直腸惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研究[3]表明，組蛋白尾部能通過甲基化共價(jià)修飾來組成組蛋白密碼，進(jìn)而調(diào)節(jié)著許多生物學(xué)行為。SetDB1是組蛋白賴氨酸N端甲基轉(zhuǎn)移酶家族中的一員，SetDB1能與異染色質(zhì)蛋白1及其共抑制子（KAP1）在異染色質(zhì)中結(jié)合，促進(jìn)H3K9me3的形成，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究顯示，SetDB1癌組織中的表達(dá)（陽性率77.78%）相對于其癌旁組織的表達(dá)（陽性率30.56%）有明顯增高，提示SetDB1有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長作用。另外，SetDB1的陽性表達(dá)與侵及肌全層及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，陽性率分別為86.36%和86.00%，差異顯著，提示SetDB1的陽性表達(dá)可能參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為。但SetDB1表達(dá)與腫瘤分化程度無關(guān)，這一結(jié)果與盧子劍等[4]研究的結(jié)果不相符，這可能與標(biāo)本選擇及數(shù)量有關(guān),從而在以后的研究中將進(jìn)一步增加標(biāo)本的數(shù)量給予實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

人體中存在原癌基因和抑癌基因，若細(xì)胞的基因發(fā)生了突變，人的免疫力就會降低。在此基礎(chǔ)上，若再受到其他不利因素的刺激，抑癌基因?qū)⑹M織細(xì)胞的抑制作用，使得組織細(xì)胞快速生長，最終演變?yōu)榘┌Y。p53基因是一種抑癌基因，具有較高的突變率，目前，已證實(shí)在腎癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥中存在p53基因突變，且50%以上的原發(fā)性腫瘤也與P53突變存在相關(guān)性[5]。本研究顯示P53癌組織中的表達(dá)（陽性率為59.72%）相對于其癌旁組織的表達(dá)（陽性率為11.11%）有明顯增高，提示腫瘤細(xì)胞的生長能促進(jìn)P53的突變。另外，p53在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中陽性表達(dá)為68.00%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示P53可能參與腫瘤的轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為。同時(shí)，在本研究中提示SetDB1和p53在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)存在中度的正相關(guān)性，說明SETDB1的存在能降低P53的抑癌作用。

綜上所述，Set-DB1和P53在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)存在中度的正相關(guān)性，說明SETDB1的存在能降低P53的抑癌作用。但通過降低SetDB1基因的表達(dá)是否也降低p53的突變而恢復(fù)p53抑制結(jié)直癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡有待進(jìn)一步研究。