脂肪干細胞與富血小板血漿治療大鼠膝骨關節炎療效比較

樓袁美 嚴佳民 邱天文 楊錦熒 單樂天*

膝骨關節炎（KOA）是一種常見的慢性和進行性骨代謝疾病，是影響老年人生活質量并引起疼痛反復發作甚至殘疾的常見原因之一。目前尚無治愈KOA的方法，大多數研究旨在減輕痛苦和防止功能衰退［1］。富血小板血漿（PRP）是可作用于自體的濃縮血小板。PRP提供的超生理量的必需生長因子可提供再生刺激，促進低愈合潛力組織的修復［2］。脂肪干細胞（ADSCs）通過釋放多種生長因子和細胞因子而起到旁分泌、抗炎和免疫調節功能，具有顯著的成軟骨作用［3］。研究證明，PRP和ADSCs均可起到治療和修復骨關節炎的作用。本研究旨在比較PRP和ADSCs對KOA病變中疼痛和軟骨損傷的影響，以尋求醫治膝骨關節炎最佳的措施。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠32只，無特定病原體（SPF）級，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，體重（200±20）g，生產許可證號：SCKK（滬）2007-0005，在浙江中醫藥大學動物實驗中心進行實驗。實驗過程符合醫學動物實驗倫理委員會標準。實驗時間2019年6 月至2020年1月。

1.2 試劑及儀器 IMDM液體培養基（美國sigma公司），戊巴比妥鈉，PBS磷酸鹽緩沖液（賽默飛世爾生物化學制品有限公司），胎牛血清，青鏈霉素混合液，0.25%胰蛋白酶-EDTA，Ⅳ型膠原酶（美國Worthington）碘乙酸（美國sigma公司），0.9%氯化鈉注射液（中國），4%甲醛溶液，EDTA脫鈣液（中國Solarbio公司），足底熱輻射測痛儀（西安峰嵐儀器廠），DK-S12型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司），SW-CJ-1F層流超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），AXiovent200熒光倒置顯微鏡（BX20）（日本Olympus公司），德國Eppendof冷凍離心機（5804R）（上海艾本德中國有限公司），全自動多功能酶標儀（美國BioTek公司），YLS-3E電子壓痛儀（安和盟天津科技發展有限公司），CO2細胞培養箱（3111）（美國Thermo公司）。

1.3 實驗方法 （1）PRP制備及質量控制：從SD大鼠外周血中分離制備PRP。隨機選取4只SD大鼠，用0.2%戊巴比妥麻醉，每只大鼠心內采血5~6 ml，將20 ml外周血收集到抗凝真空管中，以800 g離心10 min，收集血漿部分，在1000 g離心5 min，得到血小板。然后取出大部分血漿，留下3 ml血漿，使血小板再懸浮，制成1×106個/ml濃度的PRP。（2）ADSCs制備及質量控制：從SD大鼠腹股溝脂肪組織中分離制備ADSCs。隨機選取4只SD大鼠，用0.2%戊巴比妥麻醉，無菌條件下從大鼠腹股溝脂肪組織中收集脂肪組織（1.5 g），置于含Hank' s的培養皿中并用磷酸鹽緩沖液（PBS）反復洗滌3~5次，在5 min內將脂肪組織切成條。將Ⅳ型膠原酶溶于PBS中，使其濃度在25 ml中為0.12%，用于消化脂肪組織。消化過程在37 ℃水浴下進行，混合物需搖動1次/15 min。反應完成后，加入25 ml Hank's中和膠原酶活性。用100 μm的細胞篩過濾所得溶液，以1300 r/min離心6 min，去除上清液。將細胞接種于25 cm×25 cm培養瓶中，放置在37℃、5% CO2培養箱中培育。1 h后換液，定時察看細胞生長情況。換液1次/3 d，1周后傳代。給藥前收集第3代ADSCs，再次離心重懸，制成1×106個/ml濃度的ADSCs。（3）大鼠分組、造模及干預：將32只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、PRP組、ADSCs組，每組各8只。向空白組大鼠雙側膝關節腔內各注射25 mg/ml生理鹽水50 μl，模型組、PRP組、ADSCs組用同樣方法注射25 mg/ml碘乙酸50 μl，以造KOA模型。造模1周后向ADSCs組大鼠膝關節腔內注射50 μl ADSCs，PRP組注射50 μl PRP，空白組和KOA模型組注射50 μl生理鹽水，1次/周，共注射8次。（4）大鼠壓痛閾值測定：大鼠壓痛閾值用YLS-3E電子壓痛儀測定。用固定桶固定大鼠，使其保持舒適和安靜的狀態，將YLS-3E電子壓痛儀的扁型頭向大鼠后足背施壓，當大鼠因疼痛開始鳴叫或掙扎時停止施壓，此時顯示的壓力值即為大鼠的壓痛閾值，再測量另一側。在模型復制后第1周、第4周、第8周測定壓痛閾值。（5）大鼠熱痛閾值測定：大鼠熱痛閾值用足底熱輻射測痛儀測定。熱痛實驗于壓痛實驗結束6 h后進行，將大鼠置于透明有機玻璃箱內，保持室溫于23~27 ℃。等待大鼠安靜后（停止梳理毛發和探索性活動），置大鼠左后足底中央于測痛儀的“十”字形標記，注意需避開足墊，然后開啟儀器，當溫度超過大鼠的忍受程度，出現抬腿回避，將此段時間間隔作為大鼠的熱痛閾值，再測定另一側足底。每間隔5~6 min再測定一次，各3次，并取平均值。實驗時將熱痛閾值測定的時間上限設定為20 s，溫度上限設定為35 ℃，防止大鼠被熱輻射燙傷［22］。（6）膝關節組織病理學分析：造模干預8周，最后一次測定痛閾值后，將所有大鼠斷頸處死。取4組大鼠雙側膝關節并置于4%多聚甲醛中固定48 h，EDTA脫鈣4周，乙醇逐級脫水，浸蠟包埋后在切片機上沿膝關節矢狀面將脛骨外側平臺軟骨下松質骨和股骨外側髁軟骨下松質骨沿下肢縱軸方向切片，切片厚度為5 μm，切片常規脫蠟至水，經自來水沖洗后進行HE染色、封片。光學顯微鏡下觀察膝關節組織病理學改變，依照OARSI評分標準進行評分。

1.4 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，比較采用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠壓痛閾值測定結果 見表1。

表1 4組大鼠熱痛閾值比較［s，（±s）］

表1 4組大鼠熱痛閾值比較［s，（±s）］

注：與空白組比較，*P<0.01；與KOA模型組比較，#P<0.01

組別 造模后第1周 造模后第4周 造模后第8周空白組 17.47±2.52 16.64±3.38 14.20±2.54 KOA模型組 11.09±1.42* 10.79±1.43* 10.95±1.72*ADSCs組 10.93±1.74* 12.30±1.51*# 12.49±1.39*#PRP組 12.05±1.88* 12.64±1.51*# 12.40±1.23*#

2.2 4組大鼠熱痛閾值測定結果 見表2。

表2 4組大鼠壓痛閾值比較［g，（±s）］

表2 4組大鼠壓痛閾值比較［g，（±s）］

注：與空白組比較，*P<0.01；與KOA模型組比較，#P<0.01；與ADSCs組比較，&P<0.05

組別 造模后第1周 造模后第4周 造模后第8周空白組 856.25±72.92 768.75±103.20 782.50±94.90 KOA模型組 536.25±55.31* 526.25±58.88* 514.58±65.80*ADSCs組 515.93±38.00* 536.25±49.88*# 592.18±58.40*#PRP組 525.06±47.03* 566.59±74.76*# 631.87±84.94*#&

2.3 組織病理學和OARSI評分結果 病理學結果：與空白組相比較，KOA模型組大鼠膝關節軟骨表面明顯存在殘缺，損害處軟骨細胞顯著缺失，軟骨面明顯變薄，軟骨下骨出現纖維化退行性變；PRP組或ADSCs組治療均可改善KOA模型大鼠關節軟骨損害，鏡下可觀察到大量的軟骨細胞，軟骨表面平整。其中ADSCs組軟骨仍有少量軟骨細胞丟失，軟骨層輕度變薄，仍可見少量肥大軟骨細胞，軟骨下骨有少量纖維化退變；PRP組軟骨基本復原，軟骨面增厚（見圖1）。OARSI評分結果：KOA模型組OARSI評分高于空白組、RPR組和ADSCs組，差異有統計學意義（P<0.01），PRP組OARSI評分高于ADSCs組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

圖1 大鼠膝關節軟骨組織病理切片（HE染色，×100）

表3 4組大鼠OARSI評分比較（±s）

表3 4組大鼠OARSI評分比較（±s）

注：與空白組、RPR組和ADSCs組比較，*P<0.01；與ADSCs組比較，#P<0.05

組別 OARSI評分空白組 0.94±0.70 KOA模型組 4.30±1.63*ADSCs組 2.66±0.90 PRP組 1.83±1.00#

3 討論

目前KOA的臨床治療方法包括非甾體類抗炎藥（NSAIDS）、皮質類固醇和透明質酸（HA）等藥物治療，手術治療以關節置換為主［4］。但傳統保守醫學治療旨在控制癥狀而不是改變疾病本身，藥物的益處有限且具有不良的毒副作用，手術治療甚至會導致患者的持續性疼痛或功能喪失［5］。PRP治療具有操作簡單、經濟、微創等優點，可提供天然濃縮的自體生長因子（GFs），用于增強組織再生，還可被用作ADSCs的生長因子和分化因子的來源，已被證明在早期膝關節炎中具有改善疾病的作用［6］。ADSCs的免疫原性低、來源豐富、易獲得，和其他種類的MSC同樣具有成軟骨作用，能夠修復損傷的軟骨，因而可用于治療進行性發展的骨關節炎。

MOUSSA等［7］研究發現PRP能夠導致膝關節炎模型軟骨細胞MMP3，MMP13，ADAMTS-6，IL-6和Sox-2下降，同時提高TGF-β，Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的程度，從而調節軟骨細胞生存力和保護軟骨基質，抑制軟骨退行性變。TAKAGI［8］等研究發現ADSCs能降低兔KOA模型軟骨細胞MMP-1，MMP-13和ADAMTS-4的表達，從而抑制Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖的降解，抑制關節軟骨退變。但是隨著時間的推移，ADSCs在關節內的營養減弱，反而引起更為嚴重的OA。

有研究認為脂肪干細胞治療骨關節炎的證據有限，用SVF形式制備ADSCs治療骨關節炎時，有>50%研究使用PRP或纖維蛋白或PRP和纖維蛋白作為輔助［9］。有研究表明，MSC在高濃度細胞因子和白細胞存在的炎癥環境中，其細胞活力、成軟骨和成脂肪分化潛能下降，甚至對MSC的增殖和分化能力產生不良影響，且誘導細胞凋亡，損害MSC對關節炎癥的功效和治療潛力［10-11］。且干細胞采集也比PRP所需的簡單抽血更具侵襲性，這可能增加MSC治療患者發生感染或并發癥的可能性［12］。研究認為PRP通過激活α顆粒并使其蛋白如PDGF、TGF-β等脫粒與膝關節內的膠原、破骨細胞和軟骨細胞上的受體結合，分泌生長因子和抗炎細胞因子，以促進軟骨基質合成和組織再生，從而保護軟骨細胞。由于關節內干細胞存在，上述機制將更加強烈和有效，干細胞發揮其旁分泌和營養作用，還能夠分化成新的關節軟骨細胞。通過這條途徑延長PRP的作用時間，放大PRP的效應，從而更有效地修復軟骨損傷。

本研究結果顯示，在造模8周后，PRP組和ADSCs組的疼痛閾值較模型組均有提高，提示PRP和ADSCs可緩解KOA模型大鼠的膝關節炎癥，提高痛閾。在第4周和第8周，PRP組的壓痛閾值較ADSCs組高，表明PRP治療效果優于ADSCs組。在大鼠膝關節軟骨組織病理OARSI評分中，PRP組和ADSCs組OARSI評分均低于KOA模型組，表明PRP和ADSC均能修復KOA模型大鼠關節軟骨的損害。PRP組OARSI評分低于ADSCs組，表明PRP修復效果優于ADSCs組。

綜上所述，PRP和ADSCs均可提高KOA大鼠的痛閾，表明大鼠關節軟骨逐漸修復，但PRP治療KOA的效果比ADSCs的治療效果好。證明PRP對改善KOA動物模型膝關節炎癥疼痛，促進關節軟骨修復有較大的優越性，且具備較高的安全性和療效。