當歸補血湯治療化療相關性骨髓抑制作用機制的分析

羅伊揚 江婷 丁詩意 王彬彬*

化療相關性骨髓抑制是化療的常見不良反應之一，可以表現為中性粒細胞減少、淋巴細胞減少、貧血和血小板減少，且可以導致感染、出血等并發癥，從而增加發病率和死亡率［1］。現代藥理學研究表明，當歸多糖和黃芪多糖能夠激活PI3K/AKT信號轉導通路［2］，當歸補血湯的載藥血清能促進骨髓基質細胞增殖和GMCSF、IL-3的分泌，增加骨髓有核細胞抗凋亡基因Bcl-2和促細胞增殖基因cmyc mRNA表達［3］。網絡藥理學是英國藥理學家Hopkins于2007年提出的概念，是一門新興的藥理學分支學科，其在構建“藥物-成分-靶點-疾病”多層次結構網絡基礎上多分子藥物協同治療疾病的作用機制，與中醫的整體觀念相吻合。本文借助網絡藥理學，研究當歸補血湯的主要活性成分、治療化療相關性骨髓抑制的潛在靶點以及可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 當歸補血湯活性成分及靶基因的收集與篩選 中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）是一個建立在中草藥系統藥理學基礎上的數據庫及分析平臺。本實驗通過TCMSP平臺，以“黃芪”“當歸”作為關鍵詞檢索，選擇“Ingredients”，再通過設置口服生物利用度（OB）>30%，類藥性（DL）>0.18作為篩選條件，得到當歸補血湯的關鍵活性成分。再選擇“Related Targets”，篩選后獲得當歸補血湯關鍵活性成分所相對應的靶基因，并通過uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）進行基因標準化。

1.2 疾病靶基因的查找 GeneCards （https：//www.genecards.org/）是一個關于人類基因注釋性信息的全面、權威的匯編。OMIM （https：//omim.org/）是根據已出版的生物醫學文獻每天更新的一個人類基因和表型的知識庫。本實驗通過GeneCards及OMIM疾病數據庫檢索化療相關性骨髓抑制的相關靶基因。

1.3 當歸補血湯治療化療相關性骨髓抑制靶基因預測 將當歸補血湯活性成分相對應靶基因與化療相關性骨髓抑制靶基因進行成分映射，得到藥物-疾病共同靶基因，這些靶基因可能是當歸補血湯治療化療相關性骨髓抑制的關鍵靶基因，并記錄共同靶基因所對應的當歸補血湯關鍵活性成分。

1.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡的構建 將當歸補血湯的活性成分，當歸補血湯與化療相關性骨髓抑制的關鍵靶基因以及屬性關系導入到Cytoscape3.7.2中，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，實現可視化處理。在網絡圖中，節點（node）表示關鍵活性成分以及關鍵靶基因，邊（edge）表示各個節點之間的相互作用關系。

1.5 蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建 登錄STRING （Version 11.0，https：//string-db.org/），選擇“multiple proteins”，輸入當歸補血湯與化療相關性骨髓抑制的共同靶基因，選擇研究物種為“Homo sapiens”進行檢索，選擇中等置信度（0.400），得到PPI網絡，并篩選出排名前30的PPI網絡核心基因。

1.6 GO富集分析以及KEGG通路富集分析 通過Bioconductor數據庫將藥物-疾病共同靶基因轉換成entrezID。在R軟件（Version 3.6.2）安裝Bioconductor相關安裝包，設置pvalue<0.05，qvalue<0.05進行藥物-疾病共同靶基因的GO富集分析以及KEGG通路富集分析，輸出結果并繪制柱狀圖和氣泡圖。

2 結果

2.1 當歸補血湯活性成分和靶基因 TCMSP數據庫檢索到當歸補血湯共有212個活性成分，其中黃芪活性成分87個，當歸活性成分125個，經OB>30%及DL>0.18篩選后，分別剩余20個黃芪和2個當歸活性成分，見表1。再選擇“Related Targets”，篩選后獲得當歸補血湯關鍵活性成分所相對應的靶基因。其中，黃芪中共得到360個靶基因，當歸中得到52個靶基因，刪除重復項后，剩余141個靶基因，其中有33個靶基因為黃芪和當歸所共有。

2.2 藥物-疾病靶基因預測 共得到46個共同靶基因，視為當歸補血湯治療化療相關性骨髓抑制的可能的關鍵靶基因。同時，記錄共同靶基因所對應的當歸補血湯關鍵活性成分，最終得到關鍵活性成分8個，分別為Jaranol（熊竹素），hederagenin（常春藤皂苷元），isorhamnetin（異鼠李素），3，9-Di-O-methylnissolin，Bifendate（聯苯雙酯），formononetin（芒柄花黃素），kaempferol（山奈酚），Quercetin（槲皮素）。見圖1。

表1 當歸補血湯活性成分及其OB與DL值

圖1 當歸補血湯活性成分靶基因與化療相關性骨髓抑制靶基因取交集后的韋恩圖

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡 此網絡共包含56個節點，100條邊。通過網絡圖觀察到多種成分作用于同一個靶點或一種成分作用于多個靶點，表明當歸補血湯治療化療相關性骨髓抑制具有多成分、多靶點以及多作用途徑的特點。使用CentiScape2.2計算活性成分的度中心性（DC），DC是網絡分析中的一個重要指標，一個節點的DC越大，表明該節點在此網絡中的重要性越大。Quercetin（槲皮素）為28，kaempferol（山奈酚）為11，isorhamnetin（異鼠李素）為4，位于前3位。見圖2。

2.4 PPI網絡分析 將關鍵靶基因導入到STRING平臺，選擇研究物種為“Homo sapiens”，選擇中等置信度（0.400），得到PPI網絡，見圖3。該網絡包含46個節點，411條邊。通過R語言計算每個基因的連接節點的數目，從而得到前30個核心基因，見圖4。其中，AKT1、IL-6、VEGFA、CXCL8以及IL1B位于前5位。

圖2 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡（紅色-化療相關性骨髓抑制，黃色-當歸補血湯，紫色-當歸補血湯活性成分，綠色-關鍵靶基因）

圖3 PPI網絡

圖4 PPI核心基因

2.5 GO功能富集分析 當歸補血湯主要參與細胞因子活性，細胞因子受體結合，受體配體活性，生長因子受體結合，蛋白磷酸酶結合，作用于NAD（P）H、以血紅蛋白為受體的氧化還原酶活性，磷酸酶結合，血紅素結合，四吡咯結合，生長因子活性，抗氧化活性，單加氧酶活性，作用于成對供體、摻入或合并氧分子、以NAD（P）H為一個供體并摻入一個氧原子的氧化還原酶活性，核受體活性，直接配體調節的序列特異性DNA結合的轉錄因子活性等。見圖5。

2.6 KEGG通路富集分析 當歸補血湯治療化療相關性骨髓抑制的信號通路主要包括流體剪切應力與動脈粥樣硬化通路，糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路，恰加斯病通路，HIF-1信號通路，人巨細胞病毒感染通路，IL-17信號通路，TNF信號通路，JAK-STAT信號通路，鉑類藥物耐藥通路，EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路等。見圖6。

圖5 關鍵靶基因GO功能富集

圖6 關鍵靶基因KEGG通路富集

3 討論

傳統中醫并無“骨髓抑制”這一病名，通過患者乏力納差、心悸短氣、頭暈目眩、倦怠自汗等癥狀推斷出化療相關性骨髓抑制的主要病機是氣血不足［8］。而化療藥物性情剛猛，為有毒之物，易損傷臟腑。中醫學氣血生化理論認為，腎為先天之本，藏精之處，主骨生髓；脾為后天之本，氣血生化之源，故脾腎兩臟與氣血生化密切相關，治療化療相關性骨髓抑制時多從這兩臟入手。

本研究最終得到22個當歸補血湯的活性成分，預測出槲皮素，山奈酚，異鼠李素可能是當歸補血湯治療化療相關性骨髓抑制的關鍵成分。已有研究表明，槲皮素無論在體內還是體外都可以顯著降低依托泊苷對DNA的氧化損傷，同時也能顯著減少由依托泊苷引起的骨髓前體細胞和紅系有核細胞的減少［4］，另外，閔珺［5］發現槲皮素可以通過調控PI3K/Akt/FoxO1/NF-kB信號通路并抑制自由氧釋放來抵抗TNF-α誘導的骨髓間充質干細胞（BMSCs）凋亡，而BMSCs與造血干細胞關系密切，不僅對其有機械支持作用還能分泌IL-6，IL-11等生長因子促進造血。山奈酚對小型豬肝微粒體系統中的羥基自由基具有顯著保護作用，從而可以減輕阿霉素導致的骨髓抑制［6］。山奈酚也可以通過下調ROS/Fox O信號通路抑制氧化反應導致的BMSCs凋亡現象［7］。異鼠李素可以抑制RANKL誘導的骨髓巨噬細胞中的MAPK、NF-κB和AKT信號通路的活化［8］。

通過關鍵靶基因的PPI蛋白互作分析，得到PPI網絡的核心基因，其中AKT1、IL-6、VEGFA、CXCL8以及IL1B位于核心位置。AKT1基因對多種細胞功能至關重要，在PI3K/Akt1信號通路中占據重要地位，是維持長期造血干細胞功能的調節因子［9］。IL-6具有顯著造血調控作用，其具有促進造血干細胞從G0期進入G1期，促進髓系前體細胞增殖分化以及促進晚期紅系造血等功能［10］，已有研究表明IL-6可以顯著提高化療后小鼠外周血中血小板及中性粒細胞的數量［11］。VEGFA是VEGF家族中最主要的因子，其信號轉導對內皮和造血干細胞的表達至關重要［12］，而VEGF可通過自分泌環控制造血干細胞的存活和再增殖而調節造血功能［13］。CXCL8對中性粒細胞、T淋巴細胞具有趨化作用，并能促進骨髓前體細胞以及多能造血干細胞進入外周血［14］。IL1B在穩態造血和緊急造血中發揮重要作用，其可以通過誘導IL-17的產生和分泌，繼而誘導粒細胞集落刺激因子的產生和分泌促進造血干細胞和髓細胞的增殖［15］，其次，也可以通過驅動產生IL-6來進行造血調控。

當歸補血湯治療化療相關性骨髓抑制關鍵靶基因的生物學過程富集分析表明，靶基因關聯的生物學過程主要涉及細胞因子活性，細胞因子受體結合，受體配體活性，生長因子受體結合，蛋白磷酸酶結合等。這些生物學過程都在關鍵靶基因和具體通路過程中得到體現。骨髓是一個天然的低氧腔室，HIF-1信號通路介導造血干細胞對低氧的反應，可以通過調控Notch受體、VEGFA以及CXCR4保障造血干細胞的存活、調控造血干細胞的更新和分化［16］。IL-17信號通路與炎癥反應、免疫調節以及腫瘤密切相關。研究發現，大部分腫瘤患者血清中的IL-17表達水平高于正常人［17］，化療會誘導IL-17快速而顯著侵襲［18］，而IL-17過高表達則會抑制造血功能，故當歸補血湯可能通過作用于此信號通路，降低外周血中IL-17等炎性因子的表達，減少造血干細胞的破壞及骨髓微環境的失衡，從而發揮治療作用的。此外，當歸補血湯還通過細胞凋亡通路、MAPK信號通路等多個與造血功能相關的通路以及免疫相關信號通路發揮作用。

綜上所述，當歸補血湯治療化療相關性骨髓抑制體現中藥復方多成分、多靶點以及多作用途徑的特點，為后續進一步探究提供一定參考。