DAX-1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其活性的檢測(cè)

楊麗華 王芳 余柯達(dá) 鄒立波

劑量敏感的性別反轉(zhuǎn)先天性腎上腺發(fā)育不良基因1（dosage-sensitive sex reversal，adrenal hypoplasia critical region，on chromosome X，gene 1，DAX-1），又稱NR0B1（nuclear receptor subfamily 0，group B，member 1）是編碼核受體超家族1蛋白的成員。人類DAX-1 基因位于X染色體p21，編碼一個(gè)含470個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，是一種轉(zhuǎn)錄因子，主要在哺乳動(dòng)物的生殖系統(tǒng)中表達(dá)，如睪丸、卵巢、下丘腦、垂體、腎上腺等［1］。已有研究證明腎上腺發(fā)育不全、促性腺激素分泌不足的性腺機(jī)能減退及男性不育癥的發(fā)病與DAX-1突變有關(guān)［2-3］。本研究擬構(gòu)建人DAX-1 的真核表達(dá)載體，并利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄活性，為后續(xù)研究DAX-1突變致病及DAX-1表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠腎上腺皮質(zhì)瘤細(xì)胞（Y-1）購自中科院上海細(xì)胞庫，人睪丸組織的RNA、高保真DNA聚合酶購自Takara公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司，限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自NEB公司，質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、柱回收試劑盒購自O(shè)mega公司，引物合成及DNA測(cè)序于上海英濰捷基貿(mào)易有限公司完成，脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000、載體購自Invitrogen 公司，雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購自Promega公司，DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購自Gibco 公司，培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板、移液管等耗材均購于Corning公司。

1.2 方法 （1）人DAX-1基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)序列的獲取根據(jù)Gene bank中DAX-1的序列用 Prime premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物。DAX-1引物序列：上 游5'CCCAAGCTTATGGCGGGCGAGAAC 3'下 游5'CGCGGATCCCGTATCTTTGTACAG 3'分別在上游和下游引物的5'端加上Hind Ⅲ和BamH1酶切位點(diǎn)。將人睪丸組織RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，方法參照Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：cDNA（0.1 μg/μl）：1 μl；5×Prime STAR GXL Buffer：10 μl；dNTP Mixture（2.5 mM each）：4 μl；primer F（10 pM）：1 μl；primer R（10 pM）：1 μl；Prime STAR GXL DNA Polymerase：2 μl；H2O：31 μl；總體積50 μl。PCR循環(huán)條件：①98℃ 2 min；②98 ℃10 s；③60 ℃15 s；④68℃1 min 45 s；⑤重復(fù)②~④步驟，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；⑥68 ℃ 5 min；⑦4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物大小。（2）重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-3'HA-DAX1的構(gòu)建：用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，用Hind Ⅲ-HF和BamH1-HF分別雙酶切PCR產(chǎn)物和帶HA多肽標(biāo)簽的pcDNA3.1（+）' 37℃ 4 h。反應(yīng)體系分別為：①PCR產(chǎn)物30 μl；NE Buffer 4 5 μl；Hind III-HF 1 μl；BamH1-HF 1 μl；ddH20 13 μl；總體積 50 μl；②pcDNA3.1（+）-3' HA 10 μl；NE Buffer 4 5 μl；Hind III-HF 1 μl；BamH1-HF 1 μl；ddH20 33 μl；總體積50 μl。對(duì)酶切后的產(chǎn)物分別進(jìn)行柱回收和膠回收，T4 DNA連接酶連接回收后產(chǎn)物，連接體系：pcDNA3.1（+）-3'HA：2 μl；回收的DNA片段6 μl；T4 Ligase 1 μl；10×Ligation Buffer：1 μl，16 ℃ 8 h，取連接產(chǎn)物5 μl加入到50 μl DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，置于冰上30 min，42 ℃熱擊45 s，冰上放置2 min，加入600 μl不含抗生素的LB培養(yǎng)液，37 ℃搖床培養(yǎng)60 min，取200 μl涂板（含100 μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)板），放37 ℃培養(yǎng)過夜。挑克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，取陽性克隆送測(cè)序。③瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Y-1細(xì)胞：用含有10%胎牛血清DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)Y-1細(xì)胞，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，按照無菌操作臺(tái)內(nèi)的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Y-1細(xì)胞以1.5×105/孔密度接種于24孔培養(yǎng)板，待第2天細(xì)胞貼壁后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000的轉(zhuǎn)染步驟，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-3'HA-DAX1與StAR（實(shí)驗(yàn)組，各100 ng）和pcDNA3.1（+）-3'HA空載與StAR（對(duì)照組，各100 ng）分別共轉(zhuǎn)染到Y(jié)-1細(xì)胞中。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均轉(zhuǎn)染TK（10 ng）作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。上述實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3個(gè)平行孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。④熒光素酶活性測(cè)定：按照Promega公司雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒提供的操作方法檢測(cè)在Y-1細(xì)胞中DAX1對(duì)StAR啟動(dòng)子熒光素酶活性的改變。用1×PBS溶液將細(xì)胞洗滌2次，向每孔中加入100 μl 1×Passive Lysis Buffer，在室溫下輕晃15 min裂解細(xì)胞。分別取裂解液5 μl，加底物熒光素（LARII）19 μl在Modulus TM多功能光度計(jì)上測(cè)定螢火蟲熒光素酶活性，后加入終止液（STOP）19 μl檢測(cè)海腎熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶活性/海腎素?zé)晒馑孛富钚缘闹底鳛闊晒馑孛富钚浴Ｒ赞D(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-3'HA空載和StAR的Y-1細(xì)胞作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組的熒光素酶活性為其相對(duì)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 PCR法獲得DAX-1基因 利用PCR法，成功獲取約1413 bp的目的片段，見圖1。

圖1 DAX-1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-3'HADAX1雙酶切結(jié)果

2.2 重組載體的鑒定 1%瓊脂糖凝膠電泳酶切結(jié)果顯示，近1413bp處的條帶為酶切后的目的片段，測(cè)序結(jié)果也顯示該片段為DAX1編碼基因，表明pcDNA3.1（+）-3'HADAX1構(gòu)建成功。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果均一致。見圖2。

2.3 熒光素酶活性的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)組熒光比值 為（0.065±0.002）；對(duì)照組熒光比值為（0.198±0.128）， 兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3。

圖3 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)測(cè)定DAX-1活性結(jié)果

3 討論

目前全球約有15%的育齡夫婦面臨不能生育的困擾，其中50%是由于男性不育。近年來，其發(fā)病率逐年增加且逐漸傾向年輕化［4］。男性不育發(fā)病因素具有復(fù)雜性和多樣性的特點(diǎn)，其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，但從家族病例報(bào)道、小鼠模型及二代測(cè)序等的研究成果中可以推斷遺傳因素起較大作用［5］。越來越多的研究證實(shí)基因突變與男性不育的相關(guān)性［6］。這些基因的突變可使青春期發(fā)育受損，隨后由于下丘腦-垂體對(duì)性腺或其基因有重要促進(jìn)作用的因子缺乏，最終引起男性不育。DAX-1即是屬于下丘腦-垂體-性腺軸上的基因，其編碼蛋白是核受體家族的成員。DAX-1蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子對(duì)垂體促性腺細(xì)胞和腎上腺皮質(zhì)的發(fā)育起非常重要的作用，已有研究證明腎上腺發(fā)育不全及促性腺激素分泌不足的性腺機(jī)能減退的發(fā)病與DAX-1突變有關(guān)［2］。DAX-1敲除的雄性小鼠性腺機(jī)能減退、精子發(fā)生異常、生精上皮細(xì)胞退化［7］。DAX-1在大鼠Sertoli細(xì)胞中的表達(dá)受FSH激素水平的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步證明在出生后水平DAX-1可能對(duì)精子發(fā)生產(chǎn)生影響，且睪丸中DAX-1在精子發(fā)生中的作用與觀察到的某些生精障礙的腎上腺發(fā)育不全及促性腺激素分泌不足的性腺機(jī)能減退患者相一致［8］。2014年，作者對(duì)766例男性原發(fā)性無精子癥患者DAX-1基因外顯子進(jìn)行測(cè)序，同樣也證實(shí)DAX-1基因的變異與原發(fā)性無精癥的發(fā)生存在相關(guān)性，表明DAX-1可能是臨床男性不育一個(gè)潛在的診療靶點(diǎn)［3］。StAR基因編碼類固醇激素靈敏調(diào)節(jié)蛋白，主要在腎上腺、睪丸、卵巢等與類固醇激素生成有關(guān)的細(xì)胞和組織中表達(dá)。該基因的表達(dá)受許多調(diào)節(jié)因子的正負(fù)調(diào)控，這些調(diào)節(jié)因子可與StAR啟動(dòng)子上的調(diào)控元件相互作用。研究表明，DAX-1蛋白與StAR基因啟動(dòng)子區(qū)域的發(fā)夾結(jié)構(gòu)相互作用，抑制其轉(zhuǎn)錄，調(diào)控腎上腺及性腺的發(fā)育［9］，DAX-1某些點(diǎn)突變可使該抑制作用喪失，可能對(duì)精子發(fā)生產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致男性不育的發(fā)生［10］。

報(bào)告基因技術(shù)近年來普遍用于分析啟動(dòng)子活性，其靈敏度較高、檢測(cè)方便且具有內(nèi)參照，可提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確度。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)中含有在同一細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)的兩種熒光素酶，經(jīng)過內(nèi)參照的處理可以減小細(xì)胞活性和轉(zhuǎn)染效率對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，因此雙報(bào)告系統(tǒng)減少外部干擾，使實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更可信。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建人DAX-1真核表達(dá)載體并采用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)其具有轉(zhuǎn)錄活性，可與StAR啟動(dòng)子上的調(diào)控元件相互作用，明顯下調(diào)StAR基因的表達(dá)，為進(jìn)一步研究DAX-1功能及調(diào)控機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。