TEOA誘導急性髓系白血病細胞凋亡機制分析

解蓓 李艷純 王瑩 杜璟 陸曉雅 王劍超*

急性髓系白血病（AML）是一種常見的血液惡性腫瘤，其特征在于原始或未成熟細胞的過度增殖以及對正常造血干細胞的抑制［1］。據報道，AML的5年生存率（OS）極低，在年輕患者和老年患者中分別為40%，10%~20%［2］。而達到完全緩解（CR）后復發的患者也大多存活不到5年［3］。AML的治療方式主要包含誘導化療，靶向治療和同種異體造血干細胞移植（HSCT），其中阿糖胞苷和蒽環類藥物的聯合使用始終是AML誘導化療的基礎［4］。雖然誘導化療能夠部分改善年輕AML患者的預后，但大多數患者最終會出現復發或遭受化療所帶來的貧血、出血和感染等嚴重的毒副作用并最終死于該疾病［5］。而同種異體造血干細胞移植所帶來的并發癥，更是威脅患者的生命，整體預后較差［6］。2α，3α，24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸（TEOA）具有抗肝炎、抗水腫、抗結核等多種功能［7］。目前已有研究發現TEOA在多種腫瘤細胞，包括SW620、BGC823、HepG、A549和PC-3等細胞中均表現出明顯的抗腫瘤作用［8］。本文探討TEOA對人急性髓系白血病（AML）細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 RPMI 1640 、IMDM培養液購于美國Gibco公司，TEOA自制，抗P53、抗PARP、抗BaX、抗Bcl-2和抗c-Caspase3 抗體購自英國Abcam公司。碘化丙啶（批號ST511）、CCK-8試劑盒（批號C0043）、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG（批號A0216）和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（批號A0208）均購于上海碧云天生物科技公司，二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購于天津濱韻科技公司。ECL顯影液（批號FD8020）購于杭州弗德生物科技有限公司，離心機購于美國Thermo公司，普通倒置顯微鏡、正置熒光顯微鏡購于日本尼康公司，酶標檢測儀購于瑞士Tecan公司。凝膠成像儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養 人急性髓系白血病Kasumi-1、KG-1α細胞株購于中國科學院上海細胞庫，培養于10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的 RPMI 1640和IMDM培養液，在37℃、含5% CO2培養箱中進行傳代，選取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3 CCK-8檢測 選取對數生長期的Kasumi-1、KG-1α細胞，用無血清RPMI 1640和IMDM培養液配成4×104/ml懸液，吸取100 μl至96孔板中，然后放至37℃培養箱進行孵育，同時以10 mmol/L的TEOA為初始濃度，用無血清RPMI 1640和IMDM培養液進行稀釋配制不同濃度的TEOA，然后等量加入96孔板中，每個濃度設置3個復孔，同時設置不加TEOA的對照組和只加培養液的空白組，繼續于37℃培養箱孵育。經加藥24 h后避光加入等量CCK-8試劑，充分搖蕩混勻，繼續孵育4 h后，用酶標儀測得各個孔在波長為450 nm處的吸光度值（OD）。然后分別計算出各組的細胞存活率和IC50值。細胞存活率（%）=（OD藥物-OD空白）/（OD對照-OD空白）×100%。應用 Graphpad Prism 8.0軟件將測得的數據整理繪制成細胞活力曲線。后續實驗選取Kasumi-1細胞株為作用對象。

1.4 碘化丙啶（PI）染色 為了評估TEOA對Kasumi-1細胞凋亡的影響，應用PI染色法在熒光顯微鏡下觀察細胞的死亡情況。按同樣密度將Kasumi-1細胞接種到96孔板中，根據上述CCK-8檢測結果將Kasumi-1細胞分為以下4組，對照、TEOA（20 μmol/L）組，TEOA（30 μmol/L）組、TEOA（40 μmol/L）組。在37 ℃培養箱孵育24 h后，向每孔添加終濃度為10 μg/ml的PI染色液，繼續孵育10 min，然后置于熒光顯微鏡下觀察細胞核釋放的紅色熒光，紅色熒光的多少即代表細胞死亡量。

1.5 Western blot 檢測 將Kasumi-1細胞分為對照組、TEOA（10 μmol/L）組、TEOA（20 μmol/L）組，處理24 h后低溫提取細胞內蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，然后取等量蛋白上樣至12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，經轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，用TBST緩沖液洗滌3次，然后根據Marker裁剪出目的蛋白相應大小的條帶，并加入β-actin、P53、PARP、c-Caspase3、BaX、Bcl-2蛋白的抗體，于4 ℃ 搖床孵育過夜后將抗體回收，再次用TBST緩沖液洗滌條帶3次，然后分別加入山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗繼續室溫搖床孵育1 h，再次洗滌，加入ECL試劑顯影，最后用凝膠成像儀曝光分析。

1.6 活性氧（ROS）水平的檢測 以4×105細胞/ml的密度將Kasumi-1細胞接種于六孔板，然后加入配制好的20、30、40 μmol/L的TEOA藥物，并設置對照組，處理24 h后，向每孔加入終濃度為2 μmol/L的DCFHDA，繼續避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測DCF熒光強度。細胞內ROS水平與DCF熒光強度呈正相關。

1.7 統計學分析 采用GraphPad Prism 8.0統計軟件。計量資料用（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗對兩組數據進行分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TEOA對Kasumi-1、KG-1α細胞的增殖抑制作用 與對照組比較，隨著TEOA濃度的增加，Kasumi-1和KG-1α細胞活力均逐漸下降（P<0.05），TEOA作用于Kasumi-1細胞在24 h的IC50值是26.71 μmol/L；同樣濃度的TEOA作用于KG-1α細胞在24 h的IC50值是25.78 μmol/L（見圖1）。

圖1 不同質量濃度的TEOA對Kasumi-1和KG-1α細胞活力的影響

2.2 TEOA誘導Kasumi-1細胞凋亡 PI染色結果：分別以20、30、 40 μmol/L的TEOA作用Kasumi-1細胞24 h后，與0 μmol/L的TEOA組比較，隨著濃度的增加，Kasumi-1細胞死亡數量也在逐漸增加（見圖2A）。通過Western blot驗證TEOA作用于Kasumi-1細胞后凋亡相關蛋白表達情況，結果顯示：與0 μmol/L的TEOA組比較，不同濃度的TEOA處理Kasumi-1細胞后，抑癌基因P53和下游促凋亡蛋白c-Caspase3、Bax、Cleaved-PARP表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達下降（見圖2B、2C）。

圖2 A. PI染色觀察Kasumi-1細胞死亡的特征；B. Western blot檢測TEOA對Kasumi-1細胞凋亡蛋白表達的影響；C. Western blot檢測凋亡蛋白在Kasumi-1細胞中的相對表達

2.3 TEOA對Kasumi-1細胞ROS生成影響 與0 μmol/L的TEOA組比較，20 μmol/L的TEOA作用于Ka sumi-1細胞時，ROS生成的相對量為（1.45±0.14）%；30 μmol/L的TEOA作用時，ROS生成的相對量為（1.9±0.07）%，而40 μm ol/L的TEOA作用時，ROS生成的相對量為（2.43±0.08）%（P<0.05）。見圖3。

圖3 流式細胞術檢測TEOA誘導kassumi-1細胞產生的活性氧水平

3 討論

TEOA是從中華獼猴桃的根中分離的一種熊果酸型五環三萜類化合物，含量最為豐富。據報道五環三萜類化合物及其衍生物具有多種生物學作用，如抗腫瘤，抗炎癥，抗病毒和抗氧化等功能，其中抗腫瘤活性得到廣泛認可［9］。如羽扇豆醇是常見的羽扇豆烷型五環三萜類化合物，張玲莉等［10］等研究發現羽扇豆醇能通過活化Caspase通路，上調P53表達，誘導細胞凋亡及周期改變，抑制高轉移性肝細胞癌HCCLM3細胞的增殖。齊墩果酸（OA）是一種常見的果烷型五環三萜類化合物，有研究表明OA可以誘導膽囊癌GBC-SD和NOZ兩種細胞線粒體依賴性凋亡和G0/G1周期阻滯［11］。ZHANG［8］等研究證實TEOA對人類結直腸癌SW620細胞具有抗腫瘤活性，其作用機制與ROS介導細胞凋亡和線粒體自噬相關。

細胞增殖和凋亡機制失衡導致的不可控的細胞生長是大多數癌癥進展的原因，因此抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡成為評估抗癌藥物療效的重要因素［12］。通過CCK-8檢測發現，TEOA可明顯抑制Kasumi-1和KG-1α細胞的增殖，且呈濃度依賴性。隨后應用PI染色證實，與對照組相比，不同濃度的TEOA均可促進Kasumi-1細胞的死亡，且TEOA作用濃度在30 μmol/L時大量細胞出現死亡。本資料顯示，通過Wesrern blot檢測發現TEOA作用于Kasumi-1細胞后Caspase3活化片段C-Caspase3，C-PARP明顯激活，Caspase激活被認為是凋亡發生的標志［13］。因此，TEOA能通過促進細胞凋亡抑制急性髓系白血病細胞增殖，且其凋亡信號通路可能與胱氨酸蛋白酶有關。YUXINGXING［14］研究發現TEOA通過促進彌漫大B細胞淋巴瘤細胞產生ROS從而誘導DNA損傷和P38活化而發揮抗腫瘤作用。在正常生理條件下，ROS在人體內以氧化代謝副產物的形式不斷產生，且能被抗氧化劑清除［15］。但過量的ROS會對一些生物大分子造成損害，如DNA和蛋白質等［16］。越來越多的研究證實，ROS的過度積聚可通過內外凋亡途徑誘導細胞凋亡［17］。本資料結果顯示，TEOA以濃度依賴性的方式誘導Kasumi-1細胞產生ROS，提示ROS的產生可能是TEOA誘導的Kasumi-1細胞凋亡的原因。P53作為腫瘤抑制基因，在轉錄水平上調控著大量的靶基因，從而在不同的生物學過程中發揮關鍵的作用，包括DNA損傷修復、細胞周期阻滯、細胞衰老和細胞凋亡等［18］。據報道，在ROS誘導細胞凋亡過程中，P53作為下游調控因素發揮重要作用［19］。Bcl-2家族蛋白成員是線粒體依賴的內在凋亡途徑的重要因子，包括促凋亡蛋白代表Bax和抗凋亡蛋白代表Bcl-2。本實驗通過Wesrern blot檢測發現TEOA誘導的kasumi-1細胞可明顯促進P53和Bax基因的表達，降低Bcl-2的蛋白表達。此外ROS還被認為是通過與Bcl-2家族蛋白相互作用而激活多個氧化還原敏感信號級聯的第二信使［20］。綜上所述，TEOA可能通過上調ROS水平進而激活P53凋亡通路促進AML細胞凋亡。TEOA可能是治療急性髓系細胞白血病的一種有前途的候選藥物。