RSV感染性毛細支氣管炎與基質金屬蛋白酶-3基因多態性的相關性分析

楊依真 朱亞非* 王俊輝

急性毛細支氣管炎（CB）是一種常見于<2歲嬰幼兒的急性下呼吸道感染性疾病，最常見的病原體是呼吸道合胞病毒（RSV）［1］。約70%的兒童在生后第1年感染RSV，至2歲>90%兒童均感染過RSV。美國感染RSV的嬰幼兒病死率為0.0022%~0.0024%［2］，西班牙0.11%~0.18%［3］，在中低收入國家中則更高。早期評估患兒是否存在發生重癥RSV感染性毛細支氣管炎的高危因素十分重要。基質金屬蛋白酶（MMPs）是一組能特異性降解細胞外基質成分的Zn2+依賴性蛋白水解酶家族，包括MMP1-20。MMPs與RSV感染性毛細支氣管炎的發生、發展及疾病的嚴重程度、疾病后期的氣道高反應等均有密切關系［4-7］。本文探討MMP-3基因上rs522616和rs679620位點的基因多態性與RSV感染性毛細支氣管炎易感性和嚴重性的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2017年1月至2018年12月本院診斷毛細支氣管炎（參考《實用兒科學》第8版［8］）的2~24個月杭州漢族兒童145例（病例組），經鼻拭子呼吸道合胞病毒抗原檢測（膠體金法）診斷為RSV感染，根據Bearman和Pierson 修訂的臨床評分標準評分［9］分為輕、中度組（122例）和重度組（23例），由專人記錄患兒的病史資料，除去雙胎兒、早產兒、先心病、支氣管肺發育不良等基礎性疾病患兒。同時配對杭州漢族健康兒童124例為對照組，且均無毛細支氣管炎病史。另根據是否為特異性體質（既往有反復喘息史，或有嚴重濕疹史，或有藥物、食物過敏史，或過敏原檢測陽性），將所有研究對象分為特異性組（54例）和非特異性組（215例）。病例組和對照組性別、年齡差異無統計學意義（P>0.05）。在檢查前家屬均簽署知情同意書，由醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 （1）標本采集：采集患兒外周血1 ml，離心

后取血清在-80 ℃冰箱冷凍保存，后統一送至杭州祥音生物醫藥科技有限公司進行基因位點測序分析。（2）引物設計：rs522616引物序列：F-GGGAGGAGGGGAAAAGGTTG，R-GGAGGAAAACCTCATGGGCA。rs679620引物序列：F-AGGCAATGAGTAACAAGTGGA，R-CCTGTA-GGAGAAAAATTGAAGCAGA。（3）基因測序實驗流程：從標本中提取DNA后進行PCR擴增、產物電泳及純化。將純化后的產物，使用ABI.3730XL測序儀進行測序。最后使用Softgenetics公司的Mutation Surveyor軟件進行峰圖比對。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件。計數資料以n（%）表示，采用卡方檢驗。評價樣本的遺傳平衡狀態及代表性用Hardy-Weinberg平衡檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 rs522616和rs769620基因型分布平衡檢驗 見表1。

表1 rs522616和rs769620基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢驗（n）

2.2 病例組和對照組rs679620的基因型及等位基因分布 病例組和對照組rs679620位點的基因型及等位基因分布差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 rs679620基因型及等位基因分布與病情嚴重程度相關性 重度組AG基因型頻率明顯高于輕、中度組（P<0.05）。見表3。rs679620的基因型及等位基因分布與特異性體質無相關（P>0.05）。

表3 rs679620輕、中組和重組的基因型及等位基因分布［n（%）］

2.4 rs522616的多態性可能與特異性體質的相關性 基因型AA在特異性組出現頻率高于非特異性組（χ2=8.679，P<0.05）。見表4。rs522616的多態性與疾病易感性無相關（χ2=0.914、0.262，P>0.05）；且與病情嚴重程度也無相關（χ2=0.895、0.542，P>0.05）。

表4 rs522616在特異性組和非特異性組的基因型及等位基因分布［n（%）］

3 討論

RSV感染呈自限性，但重癥RSV性毛細支氣管炎可至呼吸衰竭而死亡［10］。導致RSV感染疾病嚴重度不同的原因尚不明確［11］。感染后宿主的遺傳背景可能是重要因素之一。

MMPs是一組Zn2+依賴性蛋白水解酶家族，對細胞外基質（ECM）有非常廣泛的降解功能和調節其動態平衡的能力［12］。MMP-3被認為是MMPs 家族中的一個關鍵酶，位于人基因染色體11q22. 3區域，能降解多種細胞分子和細胞外基質蛋白。MMP-3基因的多態性，目前主要有啟動子區域-1171（5A/6A）位點、5'端轉錄調控區rs522616位點、2號外顯子rs679620位點等位點的相關研究。基因的多態性是導致疾病在不同人群中的易感性及嚴重性存在差異的重要原因［13］。

SATASHI等［14］研究發現RSV感染會促進MMP-3的表達。NERUSU等［15］研究認為MMP-3有促進肺損傷的作用，推測MMP-3可能是通過直接損傷血管壁或組織間隙中連接組織的成分促進炎癥細胞的滲出，加重炎癥反應，從而加重肺損傷。ANNEMIEKE等［16］研究顯示，在中、重組RSV毛細支氣管炎患兒中MMP-3及TIMP-1的水平明顯升高，而MMP-3在重度組患兒體內升高更為明顯。通過研究MMP-3的基因多態性，發現在MMP-3基因啟動子區域的rs522616位點的A等位基因可能與RSV感染的嚴重程度有關。推測該等位基因可促使MMP-3的表達水平過度升高，從而加重肺組織損傷，這可能是造成重癥RSV感染的重要原因之一。

本研究顯示，rs679620的A等位基因在病例組出現頻率高于對照組，病例組的等位基因A分布也高于對照組。AG基因型在重度組出現的頻率高于輕、中度組，提示MMP-3基因上rs679620位點的等位基因A可能與RSV感染性毛細支氣管炎的易感性有關，基因型AG可能與疾病的嚴重程度有關。但rs679620的基因型及等位基因在特異性組和非特異性組分布差異無統計學意義。此外MMP-3 SNPrs522616基因型、等位基因頻率與RSV感染性毛細支氣管炎的易感性均無明顯相關，且在輕、中度組與重度組間差異無統計學意義。但rs522616的AA基因型在特異性體質組出現頻率明顯高于非特異性體質組，提示rs522616的AA基因型可能與人群中的特異性體質有關。本研究結果與ANNEMIEKE等報道不一致，可能與人種差異、抽樣誤差、樣本數小、生長環境等有關。因此，對于MMP-3基因多態性與RSV感染性毛細支氣管炎發生、發展的關系，還需從不同角度進行深入的研究。

本研究結果顯示，rs522616的AA基因型在特異性體質組出現頻率明顯高于非特異性體質組，提示MMP-3基因rs522616位點的AA基因型可能與特異性體質有關。特異性體質也是易誘發哮喘的因素之一，有學者認為RSV感染后引起毛細支氣管炎可能是特異性體質的早期標志［17］。也有研究認為RSV感染后是否出現喘息與特異性體質無明顯關系［18］。目前傾向RSV感染與特異性體質及其他一些先天因素可相互作用，共同促進哮喘的發生。一方面若患兒本身存在特異性體質、肺解剖及生理異常等先天因素，在RSV感染后則更易出現喘息及發展為哮喘；另一方面RSV感染后破壞氣道黏膜上皮，可降低機體對變應原的防御力，還能誘導機體免疫狀態發生改變。