新型脊柱外固定技術減少醫源性脊旁肌損傷的動物模型研究

李珊，彭文,2，晏怡果，王程，宋西正，李學林 歐陽智華，薛靜波，王文軍

1.南華大學附屬第一醫院骨科研究所，湖南 衡陽 421001；2.佛山市骨科內置物（施泰寶）工程技術研究中心，廣東 佛山 528200

交通事故及高處墜落傷常常合并胸腰椎骨折等脊柱創傷性疾病，傳統的治療方式大多采用開放內固定手術，但開放內固定手術中肌肉組織創傷大，出血多[1]，因此脊柱外固定手術應運而生。自1977年Magerl[2]首先設計并應用脊柱外固定器以來，國內外的外固定器結構大同小異[3～5]，均由椎弓根螺釘以及體外調節裝置組成。但其復雜笨重的體外調節裝置導致病人術后難以平臥；外露部件較大易致釘道感染，使其推廣應用受到限制。為盡量減輕手術創傷和患者痛苦，南華大學附屬第一醫院脊柱外科團隊根據Magerl 脊柱外固定器的三維復位原理，對椎弓根螺釘的調節裝置和脊柱外固定器的框架固定結構進行重新設計，自主研發了新型脊柱外固定器（專利號：CN201310498699.4），使其在更容易實施體外撐開復位和彈性固定的同時盡可能簡化其外部結構，降低復位器部分切跡后，該外固定系統外露部件高1 cm，術后以無菌敷料覆蓋可降低針道感染幾率，并不影響患者平臥，顯著減少手術對患者生活帶來的不便。迄今為止，該團隊及合作醫院對2000余例胸腰椎骨折患者應用了新型脊柱外固定器，其適應癥主要包括：①經影像學確診的胸腰椎新鮮爆裂性骨折，前中柱損傷為主（AO 分型A 型和B1/2型）；②椎管狹窄程度＜50%，且以椎體后緣平移為主；③椎體高度丟失＞30%，后凸畸形＞25 °；④雖有神經功能損害，但Frankel 分級為A 級的患者除外；⑤部分符合以上條件的多節段骨折[6]。通過臨床隨訪以及相關基礎研究，明確該技術能夠滿足胸腰椎骨折患者對骨折椎體撐開、提拉、撬撥復位等治療效果的要求，其術后深部感染率遠低于其他脊柱外固定技術[7]；由于該技術固定時間短，患者可早期下床功能鍛煉，減少了應力集中和應力遮擋，術后內置物失敗和鄰近節段椎間盤退變等并發癥發生率遠低于傳統開放手術，同時脊柱運動功能節段得以最大程度保留，大大降低患者術后腰背部疼痛的發生率[6,8～10]?；诖髽颖九R床應用經驗，本研究通過構建新型脊柱外固定技術以及開放內固定手術山羊動物模型，評估兩種治療方式對山羊脊旁肌損傷的影響，并闡明新型脊柱外固定器及其相關技術的作用機制[11,12]，期為脊柱外固定裝置的優化升級和臨床進一步推廣應用提供科學的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗對象及分組 選取10只1歲左右、體重（20±2.0）kg 的山羊（健康雄性本地雜交山羊），隨機分為脊柱外固定手術組、開放內固定手術組，每組5頭。X 線透視檢查排除骨病、骨畸形及外傷等特殊情況。實驗動物均由南華大學實驗動物學部統一采購管理。

1.1.2 主要設備 胸腰椎后路常用手術器械包、高頻電刀儀、山羊胸腰椎后路專用手術臺架、胸腰椎后路椎弓根釘棒系統、胸腰椎后路脊柱外固定系統（廣東施泰寶醫療科技有限公司）、Achieva 3.0 T 超高場磁共振成像系統、WDW-100微機控制萬能材料試驗機（以下稱試驗機）、XL 2118 A 靜態電阻應變儀（以下稱電阻應變儀）、100 NS 型拉伸應力傳感器（以下稱拉伸應力傳感器）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型構建 予以肌注0.02 ml/kg 鹿眠寧（鹽酸塞拉嗪注射液）進行麻醉，麻醉滿意后取俯臥位[13]。術中每30 min 肌注一次鹿眠寧0.01 ml/kg。術畢予以肌注同等劑量的陸醒寧（鹽酸苯噁唑）催醒[14]。待山羊恢復自主意識后轉運至羊舍，完全蘇醒后可正常飲食[15,16]。（1）新型脊柱外固定技術。C 臂機透視確定山羊L3節段，于L2、L4雙側椎弓根體表投影位置置入克氏針并在C 臂機透視下調整至椎弓根螺釘置釘方向，用空心套筒沿克氏針方向置入并咬定骨面后拔出克氏針，通過空心套筒置入直徑5.5 mm 的超長臂椎弓根螺釘，并在C 臂機透視下確認椎弓根螺釘位置良好。分別安裝并鎖定縱向連接棒與撬撥套件，調節其位置距山羊皮膚0.5～1 cm，剪除多余椎弓根螺釘尾端，用酒精紗布纏繞各螺釘與皮膚交界處，無菌敷料覆蓋，見圖1。（2）開放內固定手術。C 臂機透視確定山羊L3節段，做L1～5節段后路正中皮膚切口，沿棘突逐層暴露至椎板及小關節，以單齒拉鉤撐開后路皮膚及脊旁肌肉，雙關節鉗咬除進釘點部位骨贅及部分骨皮質，在L2、L4雙側制備進釘通道，分別置入直徑5.5 mm 的椎弓根螺釘4枚，C 臂機透視明確釘道角度合適。根據山羊腰椎曲度及長度，剪裁并預彎鈦棒安裝至椎弓根螺釘U 型槽內，螺帽鎖死并加壓固定，折斷椎弓根螺釘多余尾端。雙氧水及稀釋絡合碘反復沖洗傷口，逐層縫合后路肌肉、筋膜及皮膚，無菌敷料覆蓋。

圖1 山羊脊柱外固定手術后（左）及新型脊柱外固定器外觀（右）應用新型脊柱外固定器手術僅有部分椎弓根螺釘置入體內，連接棒以及撬撥套件均位于體外，體外部分總高度為2～3 cm a.撬撥套件b.連接棒c.椎弓根螺釘Fig.1 After spinal external fixation in goats(left),Spinal external fixator products(right)After the operation,only part of the pedicle screws were implanted in the body.Other connecting rods and prying kits were located in vitro,and the total height of the external part was 2～3 cm; a, prying kit; b,connecting rod;c,pedicle screw

1.2.2 大體及影像學觀察 術后3個月過量麻醉處死山羊，將手術節段腰椎（L1～5）整體取出，用生理鹽水紗布包裹[17]，將手術節段標本分別行腰椎3.0 T 核磁共振（MRI）橫斷面、矢狀面以及冠狀面，手術節段周邊各層面掃描[18]。使用Philips DICOM Viewer 3.0分別計算脊柱外固定手術組及開放內固定手術組橫斷面上脊旁肌各區域（手術區、螺釘區、鈦棒區）T2平均值，進行統計分析[19]。

1.2.3 背最長肌準靜態拉伸試驗 完成影像學評估后，兩組手術節段標本脊旁肌取材進行肌肉組織準靜態拉伸實驗。試驗機的加載速度設置為2 mm/min，即為測試應變率，將所有標本進行應變率加載，分別連續記錄數據直至測試條完全斷裂。通過已獲取的數據計算工程應力：σ=F/A，通過拉伸長度計算工程應變：ε=（L-L0）/L0，取平均值，通過σ與ε之間關系繪制應力-應變曲線，計算極限強度與破壞應變。通過以上數據計算楊氏模量：E=（F/S）/（L0/L）[20,21]。

1.2.4 病理組織學觀察 脊旁肌準靜態拉伸實驗完成后，將測試條及其外側保留完整肌肉劃分為手術區域、螺釘區域、鈦棒區域，分別將肌肉制備成邊長約10 mm 的立方塊，生理鹽水清洗后置于4%的多聚甲醛中固定，石蠟切片，HE 染色及Masson 染色，根據HE 染色通過肌纖維橫截面積量化分析肌肉組織病理變化[22,23]，通過Masson 染色評估肌肉組織內纖維增生以及炎性浸潤程度。

1.3 統計學分析

實驗數據采用SPSS 18.0進行統計學分析，計量資料以及等級資料評價指標以均數±標準差（）表示，若為正態分布且方差齊性，采用單因素方差分析，多重比較采用LSD 法；若為非正態分布或方差不齊，采用多組比較的秩和檢驗，多重比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物一般情況

開放內固定手術組1頭山羊因術中麻醉監控不佳，出現躁動，導致高頻電刀誤入椎板間隙，術后腦脊液漏，顱內感染，救治無效死亡；脊柱外固定手術組1頭山羊因術中經皮椎弓根螺釘誤入椎管，導致雙下肢癱瘓，大小便失禁，術后大劑量激素沖擊治療后，癥狀無明顯好轉，予以肌注過量麻藥處死；其他實驗動物順利完成實驗，未出現斷釘、斷棒及嚴重感染導致癱瘓或死亡。成功構建開放內固定手術與新型脊柱外固定技術動物模型各4頭，如圖2，術后飼養滿3月后予以肌注過量麻藥處死。

圖2 新型脊柱外固定技術模型（左）與開放內固定手術模型（右）Fig.2 Gross images after spinal external fixation surgery(left)and open internal fixation surgery(right)

2.2 山羊脊旁肌大體標本觀察

解剖兩組山羊模型脊旁肌標本進行手術部位周邊的大體觀察，開放內固定手術組有大量的瘢痕組織包繞在椎弓根螺釘尾端及鈦棒周圍；脊柱外固定手術組僅螺釘周圍出現少量的瘢痕組織，其他區域肌肉基本保持正常狀態，如圖3。

圖3 模型山羊脊旁肌標本大體觀察左：開放內固定手術組脊旁肌 椎弓根螺釘尾端及鈦棒周圍包繞大量瘢痕組織右：脊柱外固定手術組脊旁肌 僅螺釘周圍出現少量瘢痕組織，其他區域肌肉基本正常a：釘孔b：結締組織c：肌肉Fig.3 Open internal fixation surgery group(left),spinal external fixation surgery group(right)In the open internal fixation group,a large amount of scar tissue was wrapped around the end of the pedicle screw and titanium rod,while only a small amount of scar tissue appeared around the screw in the spinal external fixation surgery group,and the muscles in other parts remained basically normala,nail hole;b,connective tissue;c,muscle

2.3 山羊脊旁肌準靜態拉伸試驗

通過繪制兩組模型山羊脊旁肌標本準靜態拉伸應力-應變曲線，并根據其結果計算各標本的極限強度與破壞應變（表1），可明確開放內固定手術組各標本極限強度及破壞應變均小于脊柱外固定手術組，P＜0.05，有統計學差異。

表1 模型山羊脊旁肌準靜態拉伸材料性能參數（,n=8）Tab.1 Performance parameters of goat paraspinal muscle quasistatic stretching material(Mean±SD，n=8)

表1 模型山羊脊旁肌準靜態拉伸材料性能參數（,n=8）Tab.1 Performance parameters of goat paraspinal muscle quasistatic stretching material(Mean±SD，n=8)

2.4 模型山羊腰椎磁共振影像學觀察

對兩組手術節段脊旁肌標本進行3.0 T 磁共振掃描，各序列各截面背最長肌形態及信號進行無創的定性觀察與分析，開放內固定手術組橫斷面及矢狀面可見內固定裝置周邊存在大量結構顯現不清的混雜信號，特別是螺釘外側的肌肉組織中呈現代表損傷的高信號，而單純受到手術暴露影響，未安裝內置物的區域靠近棘突部位有少量的空隙存在，且周邊組織信號稍有增強。而在新型脊柱外固定技術組，僅螺釘周圍出現少量的肌肉損傷，其他部位肌肉基本保持正常狀態，見圖4。

圖4 手術節段脊旁肌各區域磁共振掃描圖像（T2W_TSE_DRIVE_HR）a：開放內固定手術組螺釘區b：脊柱外固定手術組螺釘區c：開放內固定手術組鈦棒區d：脊柱外固定手術組鈦棒區e：開放內固定手術組手術區f：脊柱外固定手術組手術區g：開放內固定手術組矢狀面h：脊柱外固定手術組矢狀面Fig.4 MRI of paraspinal muscles in different regions of operation segment(T2W_TSE_DRIVE_HR)a: screw area of open internal fixation surgery group; b: screw area of spinal external fixation surgery group; c: titanium rod area of open internal fixation surgery group; d: titanium rod area of spinal external fixation surgery group; e: surgical area of open internal fixation surgery group; f:operation area of spinal external fixation surgery group; g:sagittal plane of open internal fixation group; h: sagittal plane of spinal external fixation surgery group

對兩組模型山羊雙側脊旁肌手術區、螺釘區、鈦棒區各層面T2值共6組數據進行統計學分析（圖5），結果表明，脊柱外固定手術組螺釘區均高于該組手術區與鈦棒區，均P=0.00，手術區與鈦棒區無統計學差異（P=0.36）；開放內固定手術組鈦棒區與該組螺釘區無統計學差異（P=0.24），而其手術區與螺釘區以及鈦棒區之間均有統計學差異（P=0.00）；脊柱外固定手術組與開放內固定手術組之間比較，脊柱外固定手術組螺釘區與開放內固定手術組鈦棒區無統計學差異（P=0.07），兩組其他區域之間均具有統計學差異。以上兩兩比較采用LSD 分析，F=30.41。

圖5 手術節段脊旁肌各區域T2值Fig.5 Dorsal longest muscle T2 value data

2.5 山羊脊旁肌病理組織學觀察

兩組脊旁肌標本組織切片HE 染色結果見圖6。通過Image J 軟件計算各組各區域背脊旁肌肌纖維橫截面積并進行統計學分析（圖7），結果顯示，脊柱外固定手術組螺釘區肌纖維橫截面積均高于該組手術區與鈦棒區，具有統計學差異（P=0.02、0.03），該組手術區與鈦棒區無統計學差異（P=0.88）；開放內固定手術組鈦棒區與該組螺釘區之間無統計學差異（P=0.20），該組手術區與螺釘區以及鈦棒區之間均有統計學差異（P=0.00、0.04）；脊柱外固定手術組與開放內固定手術組之間比較，脊柱外固定手術組螺釘區與開放內固定手術組手術區無統計學差異（P=0.78），兩組其他各區域之間均具有統計學差異。以上兩兩比較采用LSD 分析，F=11.827。

圖6 手術節段脊旁肌各區域HE 染色圖像 開放內固定手術組螺釘區以及鈦棒區肌纖維之間及肌束之間間隙明顯增寬，單肌纖維的橫截面積增大，提示該區域肌肉組織為損傷狀態 開放內固定手術組手術區與脊柱外固定手術組各區域其肌束基本無萎縮或有少量萎縮，肌纖維之間及肌束之間的組織間隙較小，肌束周邊界限清晰，肌纖維橫截面基本呈多邊形，未出現橫截面變圓、肌纖維明顯萎縮及腫脹，提示該區域肌肉組織為正常狀態或損傷尚不嚴重Fig.6 He staining images of paraspinal muscles in different regions of the operation segment;In the open internal fixation group,the muscle tissue in screw area and titanium rod area showed that the tissue gap between muscle fibers and between muscle bundles was significantly widened,and the cross-sectional area of single muscle fiber was increased,indicating that the muscle tissue in this area was in a state of injury;However,in the open internal fixation group and the spinal external fixation group,there was no atrophy or a small amount of atrophy in the muscle tracts,the tissue gap between the muscle fibers and between the muscle tracts was small,and the boundary of the muscle tracts was clear.At the same time,the cross-section of muscle fiber was polygonal,and there was no cross-section roundness,muscle fiber atrophy and swelling,suggesting that the muscle tissue in this area was normal or the injury was not serious

圖7 脊旁肌各區域肌纖維橫截面積Fig.7 Transection area of paraspinal muscle fibers

兩組脊旁肌標本組織切片Masson 染色結果見圖8。通過Image J 軟件分別計算同一張切片視野內肌纖維（紅色）以及膠原纖維（藍色）的面積，計算其面積比值S肌肉/S纖維進行統計學分析（圖9）。結果表明，脊柱外固定手術組螺釘區脊旁肌Masson 染色比值均低于該組手術區與鈦棒區，具有統計學差異（P=0.00），該組手術區與鈦棒區之間無統計學差異（P=0.53）；開放內固定手術組鈦棒區與該組螺釘區之間無統計學差異（P=0.14），該組手術區與螺釘區以及鈦棒區之間均有統計學差異（P=0.00）；脊柱外固定手術組與開放內固定手術組之間比較，脊柱外固定手術組螺釘區與開放內固定手術組鈦棒區無統計學差異（P=0.10），兩組其他各區域之間均具有統計學差異。以上兩兩比較采用LSD 分析，F=152.23。

圖8 手術節段脊旁肌各區域Masson 染色圖像；在開放內固定手術組螺釘區、鈦棒區以及脊柱外固定手術組螺釘區發現肌肉組織內存在大量稀疏的纖維組織以及部分炎性組織，同時在部分損傷嚴重的肌肉組織內，甚至能夠看到部分肌細胞表現為藍染；在開放內固定手術組手術區以及脊柱外固定手術組手術區、鈦棒區中則纖維組織形態規則且未浸潤至肌肉組織內部，肌細胞表現為形態規則的紅色多邊形，未發現有細胞藍染。Fig.8 Masson stain of longest dorsal muscle Masson staining images of paraspinal muscles in different regions of operation segment;In the screw area and titanium rod area of open internal fixation group and the screw area of the spinal external fixation group,there were a large number of sparse fibrous tissue and some inflammatory tissue were found and some muscle cells were even blue stained in some severely injured muscle tissues;In the operation area of open internal fixation group and the operation area and titanium rod area of the spinal external fixation group,the fibrous tissue was regular in shape and did not infiltrate into the muscle tissue.The muscle cells showed regular red polygon in shape,and no blue staining was found.

圖9 背最長肌各區域Masson 染色肌纖維與膠原纖維面積比值Fig.9 Masson staining ratio data for the longest dorsal muscle

3 討論

3.1 不同手術方式對脊旁肌的影響

本研究制作動物模型對比新型脊柱外固定技術與內固定手術對脊旁肌的影響，通過對手術節段脊旁肌進行大體觀察和影像學分析發現，開放內固定手術組肌肉組織損傷相對嚴重，內固定節段的棘突旁幾乎沒有正常組織附著，大量無肌肉功能的瘢痕組織形成；而外固定手術組除螺釘周圍出現少量瘢痕組織，其他部位肌肉基本保持正常狀態。因此認為脊柱外固定手術能夠避免脊旁肌的剝離，減少因棘突上及小關節突周圍的部分肌腱韌帶復合體的一并切除所帶來的脊旁肌損傷，這與既往臨床資料的分析結果基本一致[24]。

本實驗還發現開放內固定手術組其外側相對正常的脊旁肌磁共振圖像上表現為損傷或炎性的高信號影，T2量化后參數明顯增高，這與相應的肌肉組織學染色形態研究基本一致，部分損傷較為嚴重的肌肉組織出現肌纖維之間及肌束之間的組織間隙明顯增寬，肌纖維結構混雜，單肌纖維的橫截面積增大。而外固定手術組則除螺釘周圍出現少量瘢痕組織，其他部位肌肉基本保持正常狀態，磁共振檢查也僅有少量高信號影，組織形態學上并無過多改變。本研究通過準靜態拉伸實驗繪制兩組肌肉組織的應力-應變曲線發現，無論是在極限強度、破壞應變以及彈性模量上脊柱外固定手術組的殘余肌肉組織均明顯優于內固定組[25,26]，這也進一步說明脊柱外固定手術相較于內固定手術能夠更好地保護脊旁肌的生物力學功能。

3.2 胸腰椎后路手術導致脊旁肌損傷機制

通過大體觀察、磁共振分析、生物力學測試以及組織學觀察，本研究明確了在脊旁肌保護意義上，脊柱外固定手術明顯優于內固定手術[27]。同時發現各組內部比較，其不同區域的肌肉損傷程度并不相同，可能是由于肌肉組織受到不同程度的人為因素干預所致。為便于分析術中脊旁肌醫源性損傷因素，本實驗對開放內固定手術節段的肌肉組織進行分區：受到手術操作以及螺釘留存影響的肌肉組織為螺釘區，受到手術操作以及鈦棒留存影響的肌肉組織為鈦棒區，僅受到手術操作影響的為手術區；外固定手術也與之對應劃分區域[28]。結果發現在內固定組手術區，其肌肉組織相對完整，存在少量肌肉組織重新附著在棘突上，但粘附并不緊密，其磁共振掃描結果以及組織學觀察同樣支持該區域的肌肉組織基本恢復正常狀態。內固定組螺釘區與鈦棒區則表現為大量瘢痕組織形成，其磁共振表現為脊旁肌存在大量表示損傷或炎性的高信號影，組織學表現為肌纖維之間及肌束之間的組織間隙明顯增寬，肌纖維結構混雜，單肌纖維的橫截面變圓、肌纖維明顯萎縮或水腫，出現明顯核內移現象，少量肌纖維呈現波浪狀（圖10）。在肌纖維橫截面積的量化評估中，損傷嚴重的分區其肌纖維橫截面積明顯大于其他各組，同時其數據的標準差也相應變大。這與既往文獻所述脊柱融合術后出現腰背部肌肉失神經支配導致肌肉萎縮的組織形態學改變不同，這種表現應為無菌性炎癥所致肌纖維損傷。特別是Masson 染色能夠在部分肌細胞內看到藍染（圖10），更加直接說明了這部分肌細胞因嚴重損傷或炎性反應，導致肌細胞膜通透性增加，大分子的苯胺藍染料可以通過肌細胞膜。而開放內固定手術組中除螺釘區肌肉組織表現有一定的組織損傷外，其他未直接接觸內置物的肌肉組織均呈正常肌肉組織表現[29,30]。因此認為開放內固定手術組大部分的肌肉損傷是因為內固定裝置長時間留置體內，對周邊肌肉組織產生長時間騷擾與擠壓而導致慢性無菌性炎癥[31]。綜上所述，新型脊柱外固定技術相較于傳統開放內固定手術，通過經皮超長臂椎弓根螺釘置釘以及改進外置固定，可避免術中廣泛剝離導致的肌腱韌帶復合體損傷，同時減少術后由于內固定裝置擠壓和干擾引發慢性炎性反應所導致的脊旁肌損傷。

圖10 損傷嚴重的肌肉組織HE 染色（左）與Masson 染色典型表現（右）左：HE 染色肌細胞同時表現為細胞萎縮以及細胞水腫，并且部分細胞能夠觀察到典型的核內移現象 右：Masson 染色肌細胞出現明顯的炎性反應，表現為肌細胞藍染Fig.10 Typical performance of HE staining(Left figure) and Masson staining(Right figure) of severely damaged muscle tissueHE staining showed that myocytes showed atrophy and edema at the same time,and some cells could observe the typical phenomenon of nuclear translocation;Masson staining showed obvious inflammatory reaction in muscle cells,which showed blue staining