高齡孕婦羊水染色體核型分析及拷貝數(shù)變異分析

張 娜，顏梅珍，王元白，江矞穎，莊建龍

（泉州市婦幼保健院·兒童醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，福建泉州 362000）

我國新生兒出生缺陷發(fā)生率約5.6%，染色體異常為其發(fā)生的重要原因[1]。對(duì)產(chǎn)前高危孕婦進(jìn)行羊水穿刺產(chǎn)前診斷是檢測胎兒染色體異常最直接、有效、不可替代的檢測手段。高齡孕婦是產(chǎn)前臨床咨詢常見的高危群體，高齡可造成卵巢功能衰退，卵子逐漸老化以及環(huán)境因素的累積，使生殖細(xì)胞或受精卵在減數(shù)分裂時(shí)期發(fā)生染色體不分離的風(fēng)險(xiǎn)增加[2]。另外，隨著我國“全面二胎”政策的開放，孕婦年齡呈增高趨勢，胎兒染色體異常發(fā)生率也隨之升高[3]。因此，對(duì)高齡孕婦進(jìn)行產(chǎn)前胎兒染色體檢測具有重要意義。

傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)，目前仍是較為常規(guī)的細(xì)胞遺傳學(xué)檢測方法，但其分辨率較低，檢測時(shí)間較長，僅可檢測≥5 Mb的遺傳物質(zhì)改變[4]。染色體微陣列分析是一種高分辨率的全基因組技術(shù)，用于鑒定染色體異常，包括常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)能夠檢測到的異常，以及小的亞顯微缺失和重復(fù)的染色體拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）。CMA 技術(shù)包括基于微陣列的比較基因組雜交技術(shù)和單核苷酸多態(tài)性微陣列（single nucleotide polymorphism array，SNP array）技術(shù)。SNP array技術(shù)不僅能夠掃描全基因組拷貝數(shù)變異，還能夠識(shí)別雜合性缺失、單親二倍體和三倍體[5-7]。目前，該技術(shù)已被推薦作為胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常的一線檢測技術(shù)[8]，但在高齡孕婦中的應(yīng)用研究相對(duì)較少。

本研究通過回顧性分析2018年1月至2020年7月至泉州市婦幼保健院行產(chǎn)前診斷的高齡孕婦1 338例，探討高齡孕婦胎兒染色體異常檢出情況，同時(shí)分析高齡孕婦胎兒染色體拷貝數(shù)變異檢出情況，探討染色體微陣列技術(shù)在高齡孕婦產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床咨詢提供數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年1月至2020年7月泉州市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心行產(chǎn)前診斷的高齡孕婦共1 338例，其中孕周18～25+6周，年齡35～52歲。本研究經(jīng)泉州市婦幼保健院·兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019No.13和2020No.31）。

1.2 羊水穿刺

對(duì)所有高齡孕婦進(jìn)行臨床咨詢，簽署知情同意書后行產(chǎn)前羊水穿刺。孕婦術(shù)前排盡膀胱，仰臥位，充分暴露腹部，通過超聲確定胎兒位置，用5 mL 注射器抽取2 mL棄去，后更換10 mL注射器，抽取實(shí)驗(yàn)所需羊水20～30 mL。羊水抽取后超聲醫(yī)生再次觀察胎兒心率及胎盤情況，并囑孕婦觀察半個(gè)小時(shí)后離開醫(yī)院。

1.3 羊水細(xì)胞培養(yǎng)及羊水染色體核型分析

將羊膜腔穿刺獲得的20 mL羊水，分裝在2個(gè)無菌刻度離心管中。離心棄上清，分別接種于兩種不同的羊水培養(yǎng)基中，進(jìn)行羊水細(xì)胞培養(yǎng)。當(dāng)有大量圓形發(fā)亮細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)，加胰酶消化進(jìn)行收獲，采用染色體自動(dòng)收獲系統(tǒng)Sinochrome ChromprepⅡ（上海樂晨生物科技有限公司）進(jìn)行染色體制備，經(jīng)吉姆薩染色后進(jìn)行核型分析。每個(gè)羊水樣本至少計(jì)數(shù)30個(gè)，分析5個(gè)核型。

1.4 羊水DNA提取及SNP array檢測

將抽取的羊水10 mL 使用QIAamp DNA Blood Kit（QIAGEN）試劑盒行羊水DNA提取。使用Affyme?trix CytoScan 750K芯片進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)變異分析。通過DGV，OMIM，DECIPHER，Pumed 等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，進(jìn)行拷貝數(shù)變異臨床意義判斷。拷貝數(shù)變異致病性的判讀參照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)指南[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高齡孕婦染色體核型結(jié)果

共1 338 例高齡孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷胎兒細(xì)胞染色體核型分析，3例培養(yǎng)失敗，成功率約99.76%（1 335/1 338）。1 335例胎兒核型分析檢測結(jié)果顯示，共檢出染色體異常159 例，包括102 例T21，15 例T18，2 例T13 和30 例性染色體非整倍體，染色體結(jié)構(gòu)異常8例，染色體嵌合2 例，見表1。染色體異常檢出率為11.91%（159/1 335），其中染色體非整倍體異常占總異常檢出93.71%（149/159）。

表1 高齡孕婦胎兒染色體核型結(jié)果

2.2 高齡合并不同高危因素間染色體異常檢出情況

本研究進(jìn)一步分析了高齡合并不同高危因素時(shí)染色體異常檢出情況，見表2。結(jié)果顯示，高齡合并不同高危因素時(shí)染色體異常檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=323.113，P<0.001）。其中，單純高齡組染色體異常檢出率為4.42%（37/838），當(dāng)高齡合并NIPT高風(fēng)險(xiǎn)或兩項(xiàng)及以上高危因素時(shí)，染色體異常檢出率較高，分別為54.62%（65/119）和61.54%（16/26），而高齡合并不良孕史時(shí)染色體異常檢出率最低（2.97%）。

表2 高齡合并不同高危因素組間染色體異常檢出情況

2.3 高齡孕婦SNP array檢測結(jié)果

本研究中，207 例高齡孕婦同時(shí)行SNP array 檢測及染色體核型分析。如表3所示，染色體核型分析及SNP array 技術(shù)均能有效檢出染色體非整倍體（T21，T18及性染色體數(shù)目異常）。另外，SNP array技術(shù)較核型分析多檢出3例致病性CNVs（1例Xq28微重復(fù)，1 例17p13.3 微重復(fù)和1 例22q11.2 微缺失）見圖1，同時(shí)，明確了1例小標(biāo)記染色體的來源。SNP ar?ray 技術(shù)還檢出20 例臨床意義不明拷貝數(shù)變異（variants of unknown significance，VOUS）。結(jié)果顯示，SNP array技術(shù)較染色體核型分析額外檢出1.45%（3/207）致病性CNVs。另外，核型分析較SNP array 技術(shù)額外檢出2例染色體平衡易位。

表3 高齡孕婦SNP array檢測結(jié)果

圖1 SNP array檢測結(jié)果

2.4 妊娠結(jié)局及生后隨訪

本研究對(duì)207例行SNP array檢測孕婦進(jìn)行妊娠結(jié)局及生后隨訪顯示，失訪14 例，隨訪率約93.24%(193/207)。其中染色體核型分析及SNP array 檢測均正常共162例，失訪5例，其余均繼續(xù)妊娠，生后隨訪體健。18 例染色體非整倍體及5 例攜帶染色體致病性CNVs均選擇終止妊娠，而2例染色體平衡易位攜帶者選擇繼續(xù)妊娠，生后隨訪體健。此外，20例攜帶VOUS 的孕婦中，5 例失訪，5 例選擇終止妊娠，10 例繼續(xù)妊娠，生后隨訪體健。

3 討論

高齡孕婦是產(chǎn)前診斷的重要對(duì)象，隨著“全面二胎”政策的開發(fā)，高齡孕婦隨之增加，同時(shí)也伴隨著胎兒染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)。因此，進(jìn)行積極的臨床咨詢及產(chǎn)前診斷尤為關(guān)鍵。本研究通過回顧性分析1 335例高齡孕婦產(chǎn)前診斷結(jié)果，探討高齡孕婦胎兒染色體核型異常及拷貝數(shù)變異檢出情況，為臨床咨詢提供參考數(shù)據(jù)。

本研究中，1 335例高齡孕婦胎兒染色體核型分析結(jié)果顯示，共檢出染色體異常159例，染色體異常檢出率為11.91%，與麥明琴等[10]報(bào)道的高齡孕婦染色體異常檢出率（10.8%）一致，但高于其他相關(guān)研究[11-12]。另外，染色體異常以非整倍體檢出為主，占總異常檢出93.71%。該結(jié)果可能與高齡導(dǎo)致卵巢功能衰退，從而使生殖細(xì)胞或受精卵在減數(shù)分裂時(shí)期發(fā)生染色體不分離的風(fēng)險(xiǎn)增加，導(dǎo)致胎兒染色體非整倍體。另外，也可能與女性特有的“交叉成熟缺陷”造成染色體重組交換錯(cuò)誤，從而導(dǎo)致胎兒非整倍體相關(guān)[13]。

為了分析高齡合并不同高危因素時(shí)染色體異常檢出是否存在差異，我們進(jìn)一步對(duì)高齡合并不同高危因素進(jìn)行分組研究。結(jié)果顯示不同組間染色體異常檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，單純高齡組染色體異常檢出率較低（4.42%），當(dāng)高齡合并其他高危因素時(shí)，胎兒染色體異常檢出均大幅增加，而當(dāng)高齡合并不良孕史時(shí)染色體異常檢出率降低2.97%。當(dāng)高齡合并NIPT高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，胎兒染色體異常檢出率較高（54.62%），該結(jié)果與NIPT高風(fēng)險(xiǎn)胎兒染色體異常檢出率相關(guān)研究一致[14-15]。因此，本研究進(jìn)一步提示了NIPT技術(shù)是一種十分有效的產(chǎn)前篩查手段。

本研究中，207 例高齡孕婦同時(shí)行SNP array 檢測及染色體核型分析。SNP array 技術(shù)能有效檢出染色體非整倍體，檢出率為100%。同時(shí)，SNP array技術(shù)較核型分析多檢出3 例致病性CNVs，提高致病性CNVs 檢出率約1.45%。同時(shí)，SNP array 技術(shù)能夠幫助明確標(biāo)記染色體的來源。本研究SNP array 檢出1例17p13.3微重復(fù)，內(nèi)含PAFAH1B1等26個(gè)OMIM基因，該基因突變/缺失與無腦回畸形疾病相關(guān)，臨床表型包括小頭畸形，發(fā)育遲緩，智力障礙，軸向肌張力減退，痙攣性四肢截癱，癲癇等。有研究報(bào)道在無腦回畸形等表型異常的患者中檢測到累及PA?FAH1B1 基因的17p13.3 區(qū)段的重復(fù)[16]。胎兒同時(shí)合并多項(xiàng)超聲指標(biāo)異常，經(jīng)充分臨床咨詢，孕婦及家屬選擇終止妊娠。另外，本研究檢出1例Xq28微重復(fù)，內(nèi)含CLIC2，RAB39B等10個(gè)OMIM基因，累及Xq28重復(fù)綜合征，臨床表型包括認(rèn)知障礙，行為異常，復(fù)發(fā)性感染，肥胖，面容異常等，但女性攜帶者可能呈現(xiàn)較輕表型，本次妊娠胎兒為女性，經(jīng)遺傳咨詢可能出現(xiàn)較輕微癥狀，孕婦及家屬選擇繼續(xù)妊娠。本研究檢出1 例22q11.21 微缺失，累及22q11.2 缺失綜合征，22q11.2缺失綜合征也被稱為DiGeorge綜合征或者腭心面綜合征等，為常染色體顯性遺傳，約93%的異常為新發(fā)生，約7%的異常為遺傳自父母[17]。臨床表型包括先天性心臟病，腭裂，面容異常，認(rèn)知障礙，免疫缺陷等。經(jīng)充分臨床咨詢，孕婦及家屬選擇終止妊娠。

目前，隨著染色體微陣列技術(shù)在產(chǎn)前診斷的不斷應(yīng)用，該技術(shù)已經(jīng)逐漸取代了傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù)。2013年美國ACOG（american college of obste?tricians and gynecologists committee）將該技術(shù)推薦作為胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常的一線檢測技術(shù)[8]。并且，有研究建議在胎兒結(jié)構(gòu)異常和/或死胎的情況下，CMA檢測應(yīng)替代染色體核型分析，同時(shí)建議接受羊膜穿刺術(shù)和絨毛膜絨毛取樣的孕婦均應(yīng)同時(shí)選擇CMA 檢測和傳統(tǒng)染色體核型分析[20]。一項(xiàng)最新研究也提示所有接受有創(chuàng)穿刺的孕婦行CMA檢測的必要性[21]。本研究顯示，核型分析較SNP array 技術(shù)額外檢出2例染色體平衡易位。染色體核型分析能夠互補(bǔ)檢出SNP array 不能檢出的染色體平衡易位、倒位等平衡重組。因此，聯(lián)合SNP array 技術(shù)及染色體核型分析能夠提高胎兒染色體異常檢出率。

本研究，SNP array 技術(shù)檢出VOUS 20 例，VOUS檢出率約9.66%，與國內(nèi)的研究報(bào)道類似[18]，高于國外報(bào)道的VOUS 檢出率[19]。本研究20 例VOUS 中，7例行父母芯片驗(yàn)證，3 例遺傳自父親，3 例遺傳自母親，1 例為新發(fā)突變。其中，仍有13 例無法明確其致病性，應(yīng)進(jìn)一步超聲隨訪，密切關(guān)注胎兒表型輔助臨床致病性判讀。因此，今后仍需要大量臨床及隨訪數(shù)據(jù)的積累，幫助VOUS的致病性判讀。

4 結(jié)論

高齡孕婦胎兒染色體異常具有較高檢出率，當(dāng)合并其他高危因素時(shí)染色體異常具有增高趨勢。另外，染色體核型分析聯(lián)合染色體微陣列技術(shù)檢測可提高胎兒染色體異常檢出率，在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用具有重要意義。