龍眼主要活性成分分析方法建立及應(yīng)用

王元園，趙文美，李 柯，曽明唐，皮 超，魏郁夢(mèng)，趙 領(lǐng)

（西南醫(yī)科大學(xué)廳市共建中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州 646000）

桂圓（龍眼）是我國(guó)南方特色水果，國(guó)家衛(wèi)生部第一批公布的可藥食兩用的特殊水果。龍眼肉含碳水化合物、黃酮類(lèi)和酚類(lèi)等多種營(yíng)養(yǎng)元素，人們常作為保健食品和滋補(bǔ)藥品[1-7]。人體新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量自由基，與動(dòng)脈硬化等多種疾病相關(guān)[8-9]。龍眼果肉中的抗氧化能力很大一部分來(lái)自龍眼多糖。姜曉坤等[10]研究發(fā)現(xiàn)多糖提取物對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基有良好的作用，從自由基學(xué)說(shuō)角度出發(fā)認(rèn)為龍眼具有抗氧化作用。另外，龍眼果肉中的多酚類(lèi)和黃酮類(lèi)物質(zhì)也具有一定的抗氧化、抗衰老作用，被譽(yù)為“第七類(lèi)營(yíng)養(yǎng)素”[9,11-12]。牛改改等[13]研究發(fā)現(xiàn)龍眼提取物多酚含量與其抗氧化能力呈正相關(guān)。除此之外，龍眼多糖類(lèi)物質(zhì)具有抗腫瘤作用。鄭少泉等[14]從龍眼果肉中提取了龍眼多糖，采取體內(nèi)移植腫瘤的方法，協(xié)同環(huán)磷酰胺抗腫瘤效果良好。

隨著桂圓果肉多種生理功效保健機(jī)理逐漸被人們認(rèn)識(shí)，已被人們推崇為“果中圣品”。然而，對(duì)桂圓活性成分進(jìn)行系統(tǒng)研究的文章很少，且缺少系統(tǒng)的含量測(cè)定的方法。在《中國(guó)藥典》中，只對(duì)其水分、灰分、性狀、浸出物量有明確規(guī)定，對(duì)其有效成分并無(wú)說(shuō)明。本研究利用紫外分光光度法系統(tǒng)地建立了龍眼各主要成分含量測(cè)定方法，并用于測(cè)定含龍眼的瀘產(chǎn)養(yǎng)生酒中部分成分的含量。

1 材料與儀器

1.1 材料

無(wú)水葡萄糖、蘆丁、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；苯酚、濃硫酸等試劑購(gòu)自成都科隆化學(xué)有限公司；亞硝酸鈉試劑購(gòu)自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；硝酸鋁試劑購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；乙醇(分析純)、氫氧化鈉、碳酸鈉等試劑購(gòu)自成都金山化學(xué)試劑有限公司；福林酚購(gòu)自成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

TGL-20B 高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；FA1104N 型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；A390型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海翱藝儀器有限公司）；SH-2磁力攪拌器（成都華衡儀器有限公司）；艾柯超純水機(jī)（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

2 方法

2.1 總糖

2.1.1葡萄糖紫外吸收行為表征

精密稱(chēng)取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于容量瓶中，加水溶解并定容，得無(wú)水葡萄糖溶液（質(zhì)量濃度為2 mg/mL）。取適量無(wú)水葡萄糖溶液于10 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，得葡萄糖稀釋液。精密量取上述稀釋液2 mL 于10 mL 具塞試管中，加入5%苯酚溶液（新制）1 mL，并迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，40 ℃水浴，保溫30 min，取出，冰水浴中5 min，靜置[15-17]。在200～800 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。

2.1.2線性與范圍

精密吸取100，125，150，175，200，225，250 μL母液于10 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，得葡萄糖稀釋液。分別精密量取上述稀釋液2 mL 于10 mL 具塞試管中，按2.1.1 項(xiàng)下方法處理。于490.5 nm 處測(cè)吸光度（A），以葡萄糖溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，以A值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

2.1.3精密度

精密量取120，170，220 μL 無(wú)水葡萄糖溶液于10 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻。分別精密量取上述稀釋液2 mL于10 mL（具塞）試管中，按2.1.1項(xiàng)下方法處理，至常溫后測(cè)值，于1 d內(nèi)測(cè)定三次，計(jì)算日內(nèi)精密度。

2.1.4回收率

精密量取120，170，220 μL 無(wú)水葡萄糖溶液于10 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻。分別精密量取上述稀釋液2 mL于10 mL（具塞）試管中，按2.1.1項(xiàng)下方法處理，至常溫后測(cè)值，計(jì)算回收率。

2.1.5穩(wěn)定性

精密量取160 μL無(wú)水葡萄糖母液于10 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，得葡萄糖稀釋液。分別精密量取上述稀釋液2 mL于10 mL具塞試管中，按2.1.1項(xiàng)下方法處理，至常溫后，分別于0、5、10、15、20、30、60、120、480 min測(cè)值。

2.1.6瀘產(chǎn)養(yǎng)生酒總糖的測(cè)定

精密量取養(yǎng)生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6適量置于容量瓶中，加入基酒定容，搖勻，得養(yǎng)身酒稀釋液。精密量取養(yǎng)生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6 稀釋液適量，置于具塞試管中，加雙蒸水至2 mL，各加5%苯酚溶液（新制）1 mL，并迅速加入濃硫酸5.0 mL，立即搖勻，40 ℃水浴，保溫30 min，取出，冰水浴中5 min，靜置，至常溫后測(cè)值。

2.2 總黃酮

2.2.1蘆丁紫外吸收行為表征

精密稱(chēng)取40 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL 容量瓶中，加水定容，得蘆丁溶液（質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL）。取適量上述蘆丁溶液于10 mL 具塞試管中，加80%乙醇溶液至5 mL，搖勻后加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，靜置6 min后加入10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，靜置6 min后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，加入80%乙醇溶液至10 mL[18-19]。在200～800 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。

2.2.2線性與范圍

精密量取0.40，0.60，0.80，1.00，1.20，1.40 mL 母液于10 mL試管中，按2.2.1項(xiàng)下方法處理。于509 nm處測(cè)吸光度（A），以蘆丁溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，以A值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

2.2.3精密度

精密量取0.50，0.80，1.30 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL試管中，按2.2.1項(xiàng)下方法處理，測(cè)值，于1 d內(nèi)測(cè)定三次，計(jì)算日內(nèi)精密度。

2.2.4回收率

精密量取0.50，0.80，1.30 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL 試管中，按2.2.1 項(xiàng)下方法處理，測(cè)值，計(jì)算回收率。

2.2.5穩(wěn)定性

精密量取母液于10 mL 試管中，按2.2.1 項(xiàng)下方法處理，分別于0、5、10、15、20、30、60、120、480 min測(cè)值。

2.2.6瀘產(chǎn)養(yǎng)生酒總黃酮的測(cè)定

精密量取養(yǎng)生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6適量置于容量瓶中，加入基酒定容，搖勻，得養(yǎng)身酒稀釋液。精密量取養(yǎng)生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6 稀釋液適量，置于具塞試管中，加80%乙醇溶液至5 mL，搖勻后加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，靜置6 min 后加入10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，靜置6 min后加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，搖勻，加入80%乙醇溶液至10 mL，測(cè)值。

2.3 總多酚

2.3.1沒(méi)食子酸紫外吸收行為表征

精密稱(chēng)取20 mg沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，加水定容，得沒(méi)食子酸溶液（質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL）。取適量上述沒(méi)食子酸溶液于10 mL試管中，加超純水至1 mL，搖勻，加入0.5 mL福林酚試劑，搖勻，加10 %碳酸鈉溶液2.5 mL，搖勻，加超純水2 mL，30 ℃水浴30 min，搖勻，靜置[20-26]。在200～1 000 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。

2.3.2線性與范圍

精密量取36，66，96，126，156，186 μL母液于10 mL試管中，按2.3.1項(xiàng)下方法處理。于769 nm處測(cè)吸光度（A），以沒(méi)食子酸溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，以A值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

2.3.3精密度

精密量取42，102，180 μL母液于10 mL試管中，按2.3.1 項(xiàng)下方法處理，測(cè)值，于1 d 內(nèi)測(cè)定三次，計(jì)算日內(nèi)精密度。

2.3.4回收率

精密量取42，102，180 μL母液于10 mL試管中，按2.3.1項(xiàng)下方法處理，測(cè)值，計(jì)算回收率。

2.3.5穩(wěn)定性

精密量取沒(méi)食子酸母液于10 mL 試管中，按2.3.1 項(xiàng)下方法處理，于0、5、10、15、20、30、60、120、480 min測(cè)值。

2.3.6瀘產(chǎn)養(yǎng)生酒總多酚的測(cè)定

精密量取養(yǎng)生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6適量置于容量瓶中，加入基酒定容，搖勻，得養(yǎng)身酒稀釋液。精密量取養(yǎng)生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6 稀釋液適量，置于具塞試管中，加超純水至1 mL 搖勻，加入0.5 mL 福林酚試劑，搖勻，加10%碳酸鈉溶液2.5 mL，搖勻，加超純水2 mL，30 ℃水浴30 min，搖勻，靜置，測(cè)值。

3 結(jié)果

3.1 總糖測(cè)定方法的建立及應(yīng)用

3.1.1紫外吸收行為表征

在200～800 nm對(duì)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液最大吸收波長(zhǎng)為490.5 nm。

圖1 葡萄糖的波長(zhǎng)掃描

3.1.2線性范圍

一系列的葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備液在490.5 nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，以藥物濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)，由圖2可見(jiàn)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為y=0.0612x-0.0238（R2=0.9999），在5.0～12.5 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，且方程擬合參數(shù)顯示線性擬合方法可靠。

圖2 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.1.3回收率和精密度

分別配制低、中、高濃度(6.0 μg/mL，8.5 μg/mL，11.0 μg/mL)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依據(jù)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)測(cè)藥物濃度、相對(duì)回收率和日內(nèi)精密度，由表1 可見(jiàn)，低、中、高濃度(6.0 μg/mL，8.5 μg/mL，11.0 μg/mL)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的回收率（%）分別為107.591、104.131、105.005，于80 %～120 %，符合分析方法的基本要求；日內(nèi)精密度（RSD%）分別為0.500、1.143、1.404；均小于2%，符合分析方法的基本要求。

表1 葡萄糖的相對(duì)回收率和日間精密度

3.1.4穩(wěn)定性

精密量取無(wú)水葡萄糖母液于10 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，得葡萄糖稀釋液，于0、5、10、15、20、30、60、120、480 min 測(cè)值，由表2 可見(jiàn)，在室溫條件下，該顯色方法480 min 內(nèi)比較穩(wěn)定，各樣品吸光度的RSD為0.045%，小于2%，滿足分析方法要求。

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品顯色反應(yīng)在室溫480 min內(nèi)穩(wěn)定性

3.1.5瀘產(chǎn)養(yǎng)生酒總糖的測(cè)定

取養(yǎng)生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6 稀釋液適量，置于具塞試管中，按2.1.6項(xiàng)下方法處理，測(cè)值。測(cè)得養(yǎng)生酒Y-3、Y-4、Y-5、Y-6 總糖含量分別為20.94、49.01、39.70、47.61 mg/mL。

3.2 總黃酮測(cè)定方法的建立及應(yīng)用

3.2.1紫外吸收行為表征

在200～800 nm對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。由圖3可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液最大吸收波長(zhǎng)為509 nm。

圖3 蘆丁的波長(zhǎng)掃描

3.2.2線性范圍

一系列的蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液在509 nm 處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，以藥物濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)，由圖4可見(jiàn)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為y=0.0128x+0.0029（R2=0.9992），在16.0～56.0 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，且方程擬合參數(shù)顯示線性擬合方法可靠。

圖4 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2.3回收率和精密度

分別配制低、中、高濃度(20.0 μg/mL，36.0 μg/mL，52.0 μg/mL)的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依據(jù)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)測(cè)藥物濃度、相對(duì)回收率和日內(nèi)精密度，由表3可見(jiàn)，低、中、高濃度(20.0 μg/mL，36.0 μg/mL，52.0 μg/mL)的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的回收率（%）分別為98.085、100.027、100.560，于80%～120%，符合分析方法的基本要求；日內(nèi)精密度（RSD %）分別為1.340、1.080、1.502；均小于2%，符合分析方法的基本要求。

表3 蘆丁的相對(duì)回收率和日間精密度

3.2.4穩(wěn)定性

精密量取蘆丁母液于10 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，得蘆丁稀釋液,于0、5、10、15、20、30、60、120、480 min測(cè)值，由表4 可見(jiàn)，在室溫條件下，該顯色方法480 min內(nèi)比較穩(wěn)定，各樣品吸光度的RSD為0.365%，小于2%，滿足分析方法要求。

表4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品顯色反應(yīng)在室溫480 min內(nèi)穩(wěn)定性

3.2.5瀘產(chǎn)養(yǎng)生酒總黃酮的測(cè)定

取養(yǎng)生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6 稀釋液適量，置于具塞試管中，按2.2.6項(xiàng)下方法處理，測(cè)值。測(cè)得養(yǎng)生酒Y-3、Y-4、Y-5、Y-6 總黃酮含量分別為69.58、50.41、292.92、387.45 μg/mL。

3.3 總多酚測(cè)定方法的建立及應(yīng)用

3.3.1紫外吸收行為表征

在200～1 000 nm 對(duì)沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描。由圖5可知，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液最大吸收波長(zhǎng)為769 nm。

圖5 沒(méi)食子酸的波長(zhǎng)掃描

3.3.2線性范圍

一系列的沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備液在769 nm 處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，以藥物濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)，由圖6可見(jiàn)，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程為y=0.1303x+0.0342(R2=0.999)，在1.2～6.2 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，且方程擬合參數(shù)顯示線性擬合方法可靠。

圖6 沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3.3回收率和精密度

分別配制低、中、高濃度(1.4 μg/mL，3.4 μg/mL，6.0 μg/mL)的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依據(jù)對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算實(shí)測(cè)藥物濃度、相對(duì)回收率和日內(nèi)精密度，由表5 可見(jiàn)，低、中、高濃度(1.4 μg/mL，3.4 μg/mL，6.0 μg/mL)的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液的回收率（%）分別為94.714、102.118、99.833，于80%～120%，符合分析方法的基本要求；日內(nèi)精密度（RSD%）分別為0.579、0.338、0.412；均小于2%，符合分析方法的基本要求。

表5 沒(méi)食子酸的相對(duì)回收率和日內(nèi)精密度

3.3.4穩(wěn)定性

精密量取沒(méi)食子酸母液于10 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，得沒(méi)食子酸稀釋液，于0、5、10、15、20、30、60、120、480 min 測(cè)值，由表6 可見(jiàn)，在室溫條件下，該顯色方法480 min 內(nèi)比較穩(wěn)定，各樣品吸光度的RSD為0.610%，小于2%，滿足分析方法要求。

表6 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品顯色反應(yīng)在室溫480 min內(nèi)穩(wěn)定性

3.3.5瀘產(chǎn)養(yǎng)生酒總多酚的測(cè)定

取養(yǎng)生酒Y-3,Y-4,Y-5,Y-6 稀釋液適量，置于具塞試管中，按2.3.6項(xiàng)下方法處理，測(cè)值。測(cè)得養(yǎng)生酒Y-3、Y-4、Y-5、Y-6 總多酚含量分別為0.597、0.291、0.473、0.555 mg/mL。

4 討論

龍眼自古以來(lái)都被當(dāng)作保健食品使用，歷史悠久，但運(yùn)用方式以直接食用果肉部分為主，對(duì)其進(jìn)行更深加工的研究屈指可數(shù)。究其根本，應(yīng)是其主要活性成分不能準(zhǔn)確測(cè)出。本研究不需要進(jìn)行復(fù)雜的純化，可通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)量龍眼主要活性成分的總量，為其進(jìn)行其他副產(chǎn)品或藥品加工奠定基礎(chǔ)。

5 結(jié)論

本研究成功建立龍眼各主要成分分析方法，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，回收率均在80%～120%之間，且在測(cè)定時(shí)間內(nèi)，顯色方法的穩(wěn)定性良好。實(shí)際操作簡(jiǎn)便，可用于含有龍眼主要成分的物質(zhì)使用。