宏基因組測序技術在兒童中樞神經系統感染性疾病中的臨床價值分析

姚仲偉 蘇淑芬 李美錦 鄒新飛 鄭愛妮 鄭亦男

廣東省婦幼保健院PICU，廣州 511400

中樞神經系統（central nervous system，CNS）感染性疾病是兒童時期嚴重的疾病，常因臨床癥狀不典型、實驗室診斷延誤導致治療不及時，病死率高，尤其是細菌性腦膜炎患者的病死率一直居高不下，且存活患者中相當一部分遺留后遺癥［1-3］。明確CNS感染的病原體對于降低CNS感染的病死率、縮短住院時間、減少后遺癥都有重要的作用。傳統的檢測方法以腦脊液涂片、細菌培養和抗原檢測為主，部分實驗室開展分子生物學檢測。但這些傳統的檢測方法總體上陽性率偏低，超過50%的CNS感染性疾病最終都無法明確病原診斷［4-6］。而病原學診斷對CNS感染的診斷及治療至關重要，故尋找一種在特異性與靈敏度方面均優于傳統檢測方法的新型檢測方法意義重大。

宏基因組測序技術（metagenomic next generation sequencing，mNGS）作為一種快速、低成本和高通量的病原體DNA測序技術，已用于CNS各類病原體感染檢測，對比傳統檢測方法具有高檢測效率和準確性［7］。本研究對兩組分別行腦脊液常規培養聯合熒光定量PCR（qPCR）和mNGS檢測的疑似CNS感染患者的相關結果進行分析，以明確mNGS在CNS感染性疾病病原檢測方面的優勢。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年4月至2020年1月入住本院PICU以發熱、抽搐、嘔吐、嗜睡等為首發癥狀，考慮CNS感染性疾病的患兒55例為觀察組，收集患兒腦脊液行mNGS檢測。選擇2018年5月至2019年4月入住本院PICU的疑似CNS感染并進行了腦脊液常規培養和qPCR檢測的患兒51例為對照組。qPCR檢測病毒指標包括：巨細胞病毒-DNA、EB病毒-DNA、單純皰疹病毒II型-DNA、單純皰疹病毒I型-DNA、人腸道病毒-RNA。觀察組年齡5個月～9歲，對照組年齡1個月～11歲。

1.2 方法 觀察組行mNGS檢測，每例患兒采集3～5 ml腦脊液樣本，無菌封存，于-20℃儲存或干冰冷鏈運送至廣州微遠基因生物公司完成檢測，包括DNA和RNA兩部分的監測。RNA部分進行了宿主細胞核糖體RNA的去除步驟以提高RNA病毒的檢測靈敏度。mNGS技術通過臨床樣本總核酸提取后，隨機引物建庫，PCR擴增出該樣本中的所有微生物，最后通過對擴增片段的序列測定和比對鑒定具體的微生物種類，然后再扣除正常人群中出現的微生物群落背景，來找到所檢測臨床標本中可能致病的微生物。對照組行常規培養檢測：收集患兒2～3 ml腦脊液樣本，送至本院微生物室，將其接種在厭氧菌、需氧菌培養基中進行培養，控制二氧化碳濃度在6%～11%，溫度控制在35～36℃，18～24 h后進行觀察，分析是否有增菌液渾濁現象或菌膜組織，提取培養液或菌膜接種在血平板中，進行病原體的分離培養，然后開展離心處理工作，圖片干燥之后，進行革蘭染色鏡檢。

1.3 觀察指標 統計觀察組和對照組病原檢測結果與兩組患兒的住院時間，了解兩種檢測方法對住院時間的影響。

1.4 統計學處理 應用SPSS22.0統計軟件對數據進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數資料以百分率（%）表示，兩組間采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩種方法病原體檢出種類的比較 在觀察組55例疑似CNS感染患兒中，24例患兒的腦脊液標本的高通量測序結果為陽性，靈敏度為43.6%，其中11例（20.0%）檢測為細菌，2例（3.6%）檢測為真菌，9例（16.4%）檢測為病毒，2例（3.6%）檢測為分枝桿菌。在病原菌檢測陽性率上高于傳統方法，差異有統計學意義，見表1。

2.2 兩種方法住院時間的比較 106例疑似CNS感染患兒，55例患兒進行mNGS檢測，住院時間為（17.19±13.3）d，51例患兒進行傳統方法檢測，住院時間為（24.90±14.8）d，差異有統計學意義（t＝2.825，P＝0.006）。

2.3 兩種方法檢測病原菌情況 在檢出的病原菌中，mNGS方法細菌檢測以肺炎鏈球菌最為常見（5/11），病毒以單純皰疹病毒6B型最為常見（3/9），真菌與分枝桿菌各2例；傳統方法細菌培養以大腸桿菌最為常見（3/6），未檢出真菌與分枝桿菌，見表2。

3 討 論

CNS感染性疾病是一種兇險的神經科疾病，致死、致殘率高，早診斷、早治療是臨床亟待解決的問題。近年來mNGS在感染領域體現出的突出作用而倍受關注，不但在目前已知可導致CNS感染的病原體方面發揮重要的診斷價值，而且在罕見病原體和跨物種傳播病原體檢測方面也發揮了無可替代的作用［8-9］。2018年有文獻報道mNGS診斷結合分枝桿菌復合群導致CNS感染的病例，之后陸續有mNGS檢出腮腺炎病毒、EB病毒、布氏桿菌、李斯特菌、腦囊蟲相關的腦炎或腦膜炎的報道。2017年，復旦大學附屬華山醫院張文宏等用mNGS在1例眼內炎患者的玻璃體中檢測到偽狂犬病毒，并且在血清中檢測到偽狂犬病毒的特異性抗體，首次在世界上證實了偽狂犬病毒的跨物種傳播。此后，國內有報道應用mNGS診斷偽狂犬病毒性腦炎。本文1例mNGS檢測到腦脊液狂犬病毒，并經廣東省疾病控制中心檢測證實為狂犬病毒陽性，更進一步證實了mNGS可以幫助病毒跨物種傳播檢出［10-16］。另外2例患者檢測到分枝桿菌，與臨床相符，經及時專科治療后預后良好，可見其對特殊病原體、罕見病原體的檢測具有相對優勢，且為解決了臨床需求。

表1 兩種方法對疑似中樞神經系統感染患兒病原體檢出種類比較[例（%）]

表2 兩種方法對疑似中樞神經系統感染患兒病原菌檢出情況（例）

在常見的細菌與病毒感染方面，兩種方法檢測結果符合中國兒童CNS感染致病菌的分布特點，但mNGS總的陽性率高于傳統細菌培養和qPCR方法，且時效性更高，統計mNGS組患者的住院時間明顯短于對照組，55例患兒進行mNGS檢測，住院時間為（17.19±13.3）d，51例患兒進行傳統方法檢測，住院時間為（24.90±14.8）d，差異有統計學意義（P＜0.05）。故認為mNGS可以使CNS感染性疾病患者獲益。

綜上所述，mNGS在腦脊液病原檢測方面較傳統的檢測方法更容易檢測到致病病原，包括罕見病原體，為治療贏得了時間窗，及時控制病情，縮短恢復時間，進而改善預后，縮短住院時間，故mNGS可以為CNS感染性疾病的診治提供可靠有效的依據，有一定的臨床應用價值。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。