基于頂空-固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿質譜聯用的訶子揮發性成分分析

譚 鵬，周永峰，黃浩洲，朱 薇，包曉明，林俊芝，張定*，趙軍寧

1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

2.島津企業管理（中國）有限公司，四川 成都 610023

3.成都中醫藥大學附屬醫院中心實驗室，四川 成都 610072

4.四川省中醫藥科學院 國家中醫藥管理局中藥質量生物評價重點研究室，四川 成都 610041

訶子Chebulae Fructus又叫訶黎勒，為使君子科植物訶子Terminalia chebulaRetz.或絨毛訶子Terminalia chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實，味酸、澀，功能澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽，臨床用于久瀉久痢、肺虛喘咳、咽痛音啞等癥[1]。訶子在藏成藥中使用廣泛，享有“藏藥之王”的美譽[2]。現代研究表明，訶子具有抗氧化[3-5]、抗菌[6-7]、抗腹瀉[8]、修復肝損傷[9-10]等多種藥理作用，具有較高的藥用開發價值。

訶子藥材聞起來有一種“酸”的嗅覺，但訶子散發出的這種“酸”氣中含有哪些化學成分，其“酸氣”強度與其質量差異是否存在關聯性等方面尚未見到相關研究報道。客觀量化評價中藥材的揮發性成分是一個難點，主要在于缺少一些高通量、準確、快速、實用的分析手段。頂空-固相微萃取（head space-solid phase micro-extraction，HS-SPME）是一種樣品前處理技術，集提取、富集、解吸和進樣等步驟于一身，具有操作簡便快速，靈敏度高，避免使用有機溶劑等特點。HS-SPME 技術適合分析易揮發性和半揮發性物質，它能全面快速地獲得樣品中揮發性物質的組成信息[11-12]。本研究嘗試基于頂空-固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿質譜聯用技術（HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS）建立一種訶子藥材揮發性快速分析方法，辨識訶子“酸氣”中的化學成分，探討不同產地訶子之間的揮發性成分差異，以期從訶子揮發性成分分析的角度為訶子的質量差異評價提供客觀數據支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TQ8050 三重四極桿氣質聯用儀（Shimadzu，日本），配備PAL 加熱磁力攪拌模塊，數據分析軟件配備 Off-flavor-TQ-MS 數據庫；PAL SPME Arrow 固相微萃取進樣器（1.5 mm×120 μm×20 mm，PN：ARR15-DVB/C-WR-120/20CT，CTC Analytics AG，Switzerland），PAL SPME Fiber 固相微萃取進樣器（95 μm×10 mm，Carbon WR Fiber，PN： FIB-C-WR-95/10， CTC Analytics AG ，Switzerland），XPE26 電子天平（Mettler Toledo 公司，瑞典）。

1.2 試藥

苯乙酮（2 μg/mL，批號48292，Sigma 公司）、萘（5 μg/mL，批號40053，Sigma 公司）、2,6-二氯苯酚（2 μg/mL，批號40302，Sigma 公司）、2,4,6-三氯苯甲醚（2 μg/mL，批號47526-U，Sigma 公司）4 種化合物用于評估系統適應性。4-溴氟苯和1,2-二氯苯-d4 的混合溶液（2 mg/mL，批號47358-U，Sigma-Aldrich 公司），苊-d10（2 mg/mL，批號48417，Sigma-Aldrich 公司）3 種化合物用作內標物。

1.3 藥材

21 批次訶子藥材來自于印度、印度尼西亞、越南、緬甸和中國云南省臨滄市等地，樣品均由成都市食品藥品檢驗研究院文永盛主任中藥師鑒定為訶子Terminalia chebulaRetz.。具體樣品信息見表1。

表1 21 個訶子樣品的采集信息Table 1 Details of 21 Chebulae Fructus samples

2 方法與結果

2.1 氣相色譜條件

色譜柱為InertCap Pure-WAX 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為250 ℃，分流進樣，分流比為5∶1，進樣口壓力為83.5 kPa；載氣為高純氦氣，載氣控制方式為恒壓力模式；吹掃流量為3.0 mL/min；程序升溫：初始溫度為50 ℃，保持5 min，以10 ℃/min 升溫至250 ℃，保持10 min；柱平衡時間為2.0 min。

2.2 質譜條件

離子源為電子轟擊源（EI），離子化能量70 eV，離子源溫度為200 ℃，質譜傳輸接口溫度為250 ℃，碰撞氣為氬氣；質譜監測模式為多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM），檢測器電壓相對于調諧結果＋0.3 kV，溶劑延遲時間為1.3 min。各化合物的監測離子對、碰撞電壓（CE）見表2。為提高檢測靈敏度，本實驗采用時間分段監測各化合物。

2.3 頂空-固相微萃取條件

訶子樣品碎粉成細粉（過三號篩），準確稱取0.5 g，置于20 mL 惰性化頂空瓶內，50 ℃平衡40 min。進樣前后，固相萃取頭在270 ℃老化裝置中自動老化3 min，通過聚四氟乙烯隔墊插入頂空瓶內，不接觸樣品，在50 ℃恒溫下萃取吸附10 min 后，抽出萃取頭，迅速插入在預運行狀態下的GC-MS 進樣口，于250 ℃狀態下解吸2 min 后，進行GC-MS/MS 分析。

表2 153 個化合物（包含3 個內標物）的監測離子對、碰撞電壓參數Table 2 Monitoring ion pairs and collision voltage parameters of 153 compounds

續表2

續表2

2.4 供試品定性定量方法

先精密吸取苯乙酮、萘、2,6-二氯苯酚和2,4,6-三氯苯甲醚等4 種化合物的混合對照溶液1 μL（在10 mL 量瓶中加入甲醇5 mL，用移液器精密吸取4 種化合物的對照品溶液各10 μL 加入量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得）進樣分析，評估儀器系統的適用性。再精密吸取4-溴氟苯、1,2-二氯苯-d4、苊-d10 等3 種內標物的混合溶液1 μL（在10 mL 量瓶中加入甲醇5 mL，用移液器精密吸取4-溴氟苯和1,2-二氯苯-d4 的混合對照品溶液、苊-d10 對照品溶液各10 μL 加入量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，用移液器精密吸取此混合溶液50 μL 加入1 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，即得）進樣分析，獲得內標物的峰面積。最后再按照上述條件測定樣品。目標化合物的定性是根據定性定量離子對確認，目標化合物的定量是根據島津TQ8050 再解析軟件內150 種化合物的標準曲線結合內標物的實測峰面積來定量。

2.5 訶子揮發性成分定性分析

定性分析結果顯示，從訶子藥材中共篩查出86 種揮發性化合物，按化合物結構可分為11 類，包括酯類、酮類、醛類、烯類、酚類、酸類、醇類、苯類、醚類、吡嗪類、酰胺類等。典型的訶子18 號供試品MRM 監測總離子流圖（TIC）見圖1，結果見表3。

圖1 典型的訶子18 號供試品MRM 監測TIC 圖Fig.1 Typical total ion chromatogram of Chebulae Fructus sample yp18

表3 9 個代表性訶子樣品中揮發性成分篩查與定量分析結果Table 3 Results of odor screening and quantitative analysis of nine Chebulae Fructus samples

續表3

2.6 訶子揮發性成分定量分析

利用內標法對訶子中篩查出的86 種揮發性化學成分進行定量分析，需要指出的是，由于缺少標準物質，本實驗采用的是數據庫里的標準曲線結合實測內標物質的峰面積進行定量分析，因此實驗中對86 種化學成分的定量只是“半定量”。由于版面篇幅限制，表3 中列出了不同產地代表性訶子樣品的定量測定結果。

2.7 不同產地的訶子揮發性成分主成分分析（principal component analysis，PCA）

鑒于測定的樣本量和揮發性成分較多，數據量較大，為了探討能否通過揮發性成分來區分不同產地訶子，采用SIMCA-P 14.1 軟件對不同產地訶子的86 種化學成分測定結果進行PCA。同時考慮到不同產地的訶子外觀性狀差異較大，以訶子的外觀性狀作為分組原則，以黃棕色且有棱的越南和中國臨滄永德產訶子作為一組，以黑色且有深皺紋的緬甸和中國臨滄永康產訶子為一組，以暗棕色且無皺紋的印度尼西亞和印度產訶子為1 組，將各組樣品的86 種揮發性物質的含量測定結果導入軟件分析。樣本間的得分圖顯示，不同產地之間的訶子有一定的區分，但區分不明顯，見圖2。以越南和中國云南臨滄產訶子為例，兩者在外觀性狀上差異較小（僅有金黃色顏色深淺差異），2 個產區的訶子在PCA 分析過程中組間區分度較小，但與其它產區的訶子組間區分度較大。組間區分結果能夠與產地分組基本吻合，這提示不同產地的訶子中揮發性成分可能存在地域特征差異，但仍需大樣本量進一步驗證。

圖2 不同產地的訶子樣品中86 種揮發性化學成分含量PCA 分析圖Fig.2 Results of PCA of 86 volatile compounds in Chebulae Fructus samples from different regions

載荷散點圖（圖3）顯示了不同揮發性化學成分對產地區分的貢獻度大小，其中貢獻度較大的化學成分或許可作為辨識不同產地訶子的特征性化合物。以貢獻度最大的化學成分α-松油醇（63 號）為例，其在21 個樣本中的質量分數平均值為0.40 pg/g，但在不同產地分組中的平均質量分數差異較大，分別為0.11（印度尼西亞＋印度）、0.62 pg/g（越南＋中國臨滄永德）、0.25 pg/g（緬甸＋中國臨滄永康）；箱式圖顯示了α-松油醇在各組含量分布的離散情況，表明其在緬甸、中國臨滄永康產的訶子樣本中含量分布差異較大，是影響產區識別的主要成分。實驗中發現乙酸的含量明顯高于其余85 個揮發性成分的含量，其在21個樣本中的含量平均值為89.79 pg/g，但其對產區識別的貢獻度并不大，箱式圖顯示其在樣本間的含量分布差異大小為緬甸＋中國臨滄永康＞印度尼西亞＋印度＞越南＋中國臨滄永德，見圖4。

圖3 不同產地的訶子樣品中86 種揮發性化學成分含量PCA 載荷散點圖Fig.3 Loading scatter plot of PCA analysis of 86 volatile chemical compounds in Chebulae Fructus samples from different regions

圖4 不同產地的訶子樣品中α-松油醇和乙酸含量分布情況Fig.4 Content distribution of α-terpineol and acetic acid in Chebulae Fructussamples from different regions

3 討論

實驗中比較了SPME Arrow 和SPME Fiber 2種固相微萃取進樣器對訶子中揮發性成分的萃取效率和檢測靈敏度。和SPME Fibe 相比，SPME Arrow 樣品萃取時間顯著縮短，減少了轉移過程中分析物的損失，使得檢測靈敏度高于 SPME Fiber，因此最終優選SPME Arrow 作為本實驗的固相微萃取進樣器。訶子的化學成分主要有鞣質類[13-15]、三萜類[16-17]、黃酮類[18]等。有文獻報道訶子藥材中含有揮發性成分[19-20]，本研究進一步明確了訶子藥材中至少有86 種揮發性成分，按化合物結構可分為酯、酮、醛、烯、酚、酸、醇、苯、醚、吡嗪、酰胺11 類，且主要為脂溶性成分，豐富了訶子藥材的化學成分研究。訶子藥材中含有大量乙酸、月桂酸等有機酸類成分，總體表現出“酸”的復合嗅氣。不同產地之間的訶子中揮發性成分的種類基本一致，但在含量上存在一定差異，提示不同產地的訶子中揮發性成分的累積可能存在地域特征，但仍需用大樣本量數據進一步驗證。

本實驗基于HS-SPME/GC-QQQ-MS/MS 技術建立了一種訶子中150 種揮發性成分快速篩查和定量分析方法，具有高通量、快速、準確和簡便的特點，對其它中藥材的揮發性成分分析具有參考價值。

志謝：成都市荷花池中藥材市場楊定明對樣品收集做出的貢獻，成都市食品藥品檢驗研究院文永盛主任中藥師和成都市三勒漿藥業集團樊三虎高級工程師對樣品鑒定做出貢獻。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突