青蒿素類化合物抗腫瘤作用激活機制的研究進展

廖 媛，王鈺婷，羅賢強，羅開麗，萬少翔，卿 晨

昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500

青蒿素來源于菊科植物黃花蒿Artemisia annuaL.，是一種含有過氧橋的倍半萜內酯類化合物，極大地改善了瘧疾的治療效果[1]。多年來，人們對青蒿素類化合物的研究并沒有止步于抗瘧作用，其在抗腫瘤、抗寄生蟲?。ǔ懠餐猓?、抗病毒及抗炎等方面也具有藥理活性[2]。青蒿素為無色針狀結晶，味苦，可溶于有機溶劑，在對其結構進行修飾后得到了抗瘧活性更好的雙氫青蒿素，為了改善雙氫青蒿素分子中化學性質不穩定的半縮醛結構，經進一步的結構修飾得到了蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯等溶解性更好的化合物[3]。青蒿素類化合物的共性是其分子中均存在一個過氧橋結構，研究表明，過氧橋是青蒿素發揮藥理活性的必需結構，失去過氧橋結構后其藥理活性顯著降低[4]。自青蒿素被發現以來，研究人員就努力探索青蒿素的抗瘧作用機制，希望更合理地應用青蒿素類化合物，減少瘧原蟲對青蒿素耐藥性的發生，并為青蒿素的多種藥理學作用研究提供依據。

在抗腫瘤研究方面，2003年，美國國家癌癥研究所以包括白血病、黑色素瘤、非小細胞肺癌、結腸癌、卵巢癌、中樞神經系統腫瘤、前列腺癌和乳腺癌在內的55 株腫瘤細胞株為模型，對青蒿素類化合物青蒿琥酯的細胞毒活性進行了篩選，發現其對各類腫瘤細胞都有一定的抑制作用，尤其對白血病和結直腸癌細胞株的抑制活性更高[5]。這一結果也是近20年來青蒿素類化合物抗腫瘤研究的重要基礎。

從已有研究結果看，青蒿素對正常人組織細胞的體外抑制作用較小，因而認為其安全性較好[6-7]。在抗腫瘤實驗中，也發現若將青蒿素與有效的激活劑聯用，被激活后的青蒿素效果會比單獨給藥（無激活劑）時更好[2,8]。由于腫瘤細胞復雜的內環境，使得影響青蒿素激活的因素和青蒿素的作用靶點未有結論。在抗瘧機制中，瘧原蟲消化紅細胞釋放出大量亞鐵離子（Fe2+）和血紅素，這類還原物質使青蒿素過氧橋斷裂，生成碳自由基；并通過抑制瘧色素形成，使蛋白質烷基化等方式殺死瘧原蟲[9]。腫瘤細胞是一類生長失控的快速增殖細胞，其細胞內的血紅素及Fe2+是其生長增殖所必需的。研究顯示，腫瘤細胞內血紅素及Fe2+的含量普遍較正常細胞高，可能成為青蒿素類化合物發揮抗腫瘤作用的生物學基礎[10-11]。多年來，對青蒿素發揮療效的生物學基礎及激活機制的探索從未止步，希望發現青蒿素類化合物的特點和優勢，為發揮其多方面的臨床作用、拓展其應用提供科學依據。本文對近年來有關腫瘤細胞中青蒿素及其類似物激活因素的研究進展進行綜述，為深入研究其抗腫瘤作用提供依據。

1 Fe2+對青蒿素類化合物的激活作用

1995年，Lai 等[10]用雙氫青蒿素聯合轉鐵蛋白作用于人急性淋巴母細胞白血病MOLT-4 細胞株，發現其能有效抑制MOLT-4 細胞的增殖，而且兩者的聯用對正常人淋巴細胞的影響較??；之后在乳腺癌細胞和正常乳腺細胞中的實驗也得到了相似的結果[6]。轉鐵蛋白的功能是結合外周血中的鐵離子（Fe3+），將Fe3+通過細胞內吞作用進入細胞，隨即在細胞內還原物質作用下，Fe3+還原成為Fe2+，繼而參與DNA 合成等細胞活動[12]。對青蒿素類化合物在Fe2+依賴下發揮抗腫瘤作用機制的研究也發現，在白血病、宮頸癌等細胞中存在的Fe2+確實與青蒿素的激活相關，并發現了Fe2+催化的過氧橋是通過發生芬頓反應生成活性氧（reactive oxygen species，ROS），從而發揮破壞腫瘤細胞的作用[13-14]。此后根據腫瘤細胞表面轉鐵蛋白的高表達及腫瘤細胞的高鐵環境，陸續開展青蒿素激活機制的研究，并認為轉鐵蛋白、氧化鐵納米材料等可作為青蒿素的載體，實現針對腫瘤細胞的靶向給藥，并在一定程度上提高了青蒿素的抗腫瘤效果[15]。這些研究結果支持游離鐵激活青蒿素發揮抗腫瘤作用的推測。Efferth 等[16]用甘氨酸硫酸亞鐵聯合青蒿素作用于人急性淋巴細胞白血病T 淋巴CCRF-CEM 細胞株和人星形膠質細胞瘤U373 細胞株，兩者的生長都受到了明顯的抑制，認為此效果是由于Fe2+介導了青蒿素的激活。但也強調，即使沒有外源性Fe3+的供應，青蒿素、青蒿琥酯也仍然具有活性，但由于細胞生物學基礎的不同，其抗腫瘤作用也存在很大差異。幾年后，該團隊擴大實驗對象，用36 株腫瘤細胞研究了Fe2+與青蒿琥酯發揮細胞毒活性的關系，這些細胞株包括結直腸癌、胃癌、乳腺癌、黑色素瘤、頭頸部腫瘤等，結果發現，青蒿琥酯單用和聯用對大部分腫瘤細胞均有抑制作用，但其中的11 株腫瘤細胞在聯用甘氨酸硫酸亞鐵時的半數抑制濃度并沒有比單用青蒿琥酯低，提示Fe2+對青蒿素的激活并不是普遍發生在腫瘤細胞中[17]。

關于Fe2+激活青蒿素類化合物，其在抗腫瘤方面的研究晚于在抗瘧作用中的研究，實際的情況及得到的結果也更為復雜。因此，目前Fe2+激活青蒿素類化合物發揮抗腫瘤作用的假說尚不能確定。

2 血紅素對青蒿素類化合物的激活作用

近年來，研究較多的另一類青蒿素類化合物的激活因素是血紅素。血紅素是含有Fe2+的卟啉類化合物，廣泛參與細胞代謝，也是許多蛋白如血紅蛋白、肌紅蛋白、細胞色素P450、過氧化物酶及細胞色素C 等的輔基，細胞色素中的血紅素還參與線粒體電子傳遞鏈/線粒體呼吸鏈（mitochondrial electron transport chain，ETC）的電子傳遞[18]。血紅素還是具有潛在殺傷作用的一類生物因子，過多游離的血紅素會形成ROS，通過氧化應激反應損傷細胞膜、破壞組織細胞[19]。紅細胞內期的瘧原蟲吞食血紅蛋白以滿足其對大量氨基酸的需求，消化血紅蛋白后產生的血紅素在食物泡中的濃度可達到 0.4 mol/L[1]。如此多的血紅素勢必會損傷瘧原蟲體內的膜結構，于是瘧原蟲就將血紅素打包成瘧原素，減小游離血紅素濃度，達到存活的目的[1]。研究表明，即使是從形成瘧原素過程中漏出的少量游離血紅素也可有效地激活青蒿素[20]。正常人體的外周血和正常細胞內的血紅素濃度都受到嚴格的調節和控制，維持在0.2～0.6 μmol/L 的較低水平。研究顯示，腫瘤細胞中的血紅素含量要高于正常細胞，這有利于腫瘤細胞的生長增殖[21-22]。

20 世紀90年代，Yang 等[23]在研究青蒿素發揮抗瘧作用中的激活因素時發現，青蒿素可與細胞色素C、血紅蛋白結合，在體外可使蛋白烷基化，而不與不含血紅素的珠蛋白反應，表明青蒿素在血紅素的作用下產生自由基，并獲得烷基化蛋白質的能力。此后的研究證明，在抗腫瘤中血紅素是激活青蒿素的主要及重要因子[11]。在體外，Zhang 等[24]采用血紅素、氯化血紅素、血紅蛋白和亞鐵氰化物分別與青蒿素在特定的情況下進行反應，結果顯示，血紅素能在更短的時間內與青蒿素發生反應，并且表示血紅素也可能是激活青蒿素發揮抗腫瘤作用的主要因素。

根據血紅素的生物合成途徑，以線粒體中甘氨酸和琥珀酰輔酶 A 在 5-氨基乙酰丙酸合成酶（aminolevulinic acid synthase，ALAS）作用下合成5-氨基乙酰丙酸（aminolevulinic acid，ALA）為起始，經由一系列生物合成反應，最終生成血紅素（圖1）[11]。琥珀酰丙酮（succinyl acetone，SA）是研究血紅素合成途徑常用的阻斷劑，它通過抑制ALA 縮合成原卟啉使后續步驟無法進行，導致血紅素合成失敗[25]。研究發現，腫瘤細胞的快速增殖不僅與血紅素的含量增加有關，其細胞內的甘氨酸和ALAS 同樣比正常細胞內的水平要高[11,26]。基于以上原理，Gerhard課題組[27]將雙氫青蒿素分別與ALA、原卟啉Ⅺ、轉鐵蛋白聯用增加其對MOLT-4 細胞的細胞毒作用，并用SA 阻止其細胞毒性，結果表明，ALA 這個由限速酶合成且為血紅素合成途徑的上游分子，在與雙氫青蒿素聯用后的效果最好，而SA 與雙氫青蒿素聯合應用后，則大部分逆轉了雙氫青蒿素的細胞毒性。之后，該研究組在此基礎上進一步證實雙氫青蒿素聯合ALA能在MOLT-4細胞中產生大量ROS，因而發揮更強的細胞毒活性作用[28]。Wang 等[11]研究發現，將青蒿琥酯與ALA 聯用，在體內外均能抑制結直腸癌HCT-116 細胞株及其移植瘤的生長，通過比較HCT-116 細胞和正常結腸上皮CDC841 細胞株內的血紅素含量發現，ALA 通過促進腫瘤細胞血紅素的合成，增強青蒿琥酯對HCT-116 細胞的細胞毒性。青蒿素二聚體是2 分子青蒿素母核通過不同連接子連接起來的一類化合物，其中含有2 個過氧橋結構[29]。Stockwin 等[30]在研究青蒿素二聚體（NSC724910 和NSC735847）對人早幼粒白血病HL-60 細胞株和前列腺癌PC-3 細胞株的細胞毒活性中也發現血紅素的調控對激活二聚體十分重要，鈷卟啉能增強血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）活性，使其加快對血紅素的代謝，從而抑制青蒿素二聚體的活性；鋅卟啉抑制HO，則增強了青蒿素二聚體的毒性。另外，有研究通過干擾ALAS 等血紅素合成途徑的酶來研究血紅素對青蒿素的激活作用，也得到了相似的結果[31]。腫瘤細胞中血紅素對青蒿素的激活效率比鐵更高，但目前研究采用的腫瘤細胞株模型總體還較少，要確認血紅素是青蒿素激活因素的假說還有很多工作要做。

3 線粒體對青蒿素類化合物的激活作用

雖然血紅素激活青蒿素后表現出了較好的抗腫瘤效果，但加入腫瘤細胞的血紅素劑量卻需要認真推敲，因為血紅素是細胞內多種重要蛋白的輔基，可多方面參與細胞生物學功能的調節，其含量的異常與多種疾病相關。Kalainayakan 等[32]的研究指出，直接增加線粒體內的血紅素會促使肺癌復發。在腫瘤細胞中，線粒體作為青蒿素的激活因素也是一大研究熱點。釀酒酵母是研究線粒體的經典模式生物之一，2005年，Li 等[33]從該模型中發現青蒿素可以使線粒體膜電位去極化，干擾ETC 后，青蒿素的作用效果下降。之后他們對給藥2 h 后伯氏瘧原蟲感染小鼠的紅細胞進行了分離，從中檢測到瘧原蟲線粒體的去極化，加入還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脫氫酶抑制劑（抑制ETC）后與青蒿素聯用減弱了青蒿素的抗瘧疾效果[34]。這是提出血紅素、Fe2+是青蒿素激活因素觀點后的又一新發現。為繼續深入研究，Sun 等[35]培養了一種酵母血紅素合成途徑中的合成酶HEM2基因敲除酵母株，分別在發酵和非發酵培養基上培育，酵母在非發酵培養基上需要線粒體的呼吸作用，發酵培養基中則不需要線粒體進行呼吸作用。在發酵培養基上，只有血紅素高低表現出對青蒿素敏感性的變化，但在非發酵培養基上0.1 μmol/L 青蒿素可抑制HEM2基因敲除酵母的生長，正常酵母則需要在5 μmol/L 時才能出現相同抑制效果，因此認為線粒體激活較少的青蒿素，就能達到一定的抑制作用，而血紅素會讓青蒿素迅速消耗，使依賴線粒體（可能是ETC）激活的部分隨之減少。實驗中，雖然HEM2基因敲除的酵母血紅素合成途徑被阻斷，但檢測到其在有無青蒿素時的呼吸活性并無變化，說明ETC 及其中的血紅素沒有受到青蒿素的影響[35]。以上結果提示，在某些生物（酵母和瘧原蟲）中，增加血紅素的合成并不一定能增強青蒿素的活性，線粒體也可能激活青蒿素并介導更靈敏的殺傷方式。Mercer 等[36]以缺乏功能性ETC 的人宮頸癌HeLa ρ0 細胞株和正常HeLa 細胞株為模型，發現雖然大劑量的青蒿琥酯對HeLa ρ0細胞株仍有細胞毒活性，但正常的HeLa 細胞對青蒿琥酯更敏感，而HeLa ρ0 細胞株和正常HeLa 細胞株中的碳自由基含量大致相同，說明ETC 是介導青蒿琥酯發揮作用的部分原因。但ETC 是否是青蒿素類化合物的激活因素還有待進一步探討。

圖1 外源性調節因素對腫瘤細胞內血紅素合成途徑的影響Fig.1 Effects of exogenous modulators on heme biosynthetic pathway in tumor cells

在許多研究中發現，青蒿素類化合物在單用或聯合抗腫瘤藥物時可以破壞腫瘤細胞的線粒體，顯著降低線粒體膜電位[37-38]。線粒體膜電位的損傷可以激活腫瘤細胞的內源性凋亡途徑，導致細胞死亡[39]。還有部分文獻報道，青蒿素類化合物增加腫瘤細胞的ROS 不一定能引起細胞凋亡，它們甚至不會改變細胞ROS 的含量，這可能由于細胞的生理環境不同造成[38,40]。因此，線粒體介導的細胞凋亡可能是青蒿素類化合物抑制腫瘤細胞增殖的一種穩定方式。通過將青蒿素靶向輸送到線粒體（血紅素的合成部位），結果發現在線粒體聚集的青蒿素有更強的抗腫瘤作用[41]。Sun 等[42]還提出靶向線粒體后，青蒿素在增強抗腫瘤作用的同時會減弱其抗酵母及抗瘧疾的能力。以上結果表明線粒體很可能與血紅素是通過不同的途徑增強了青蒿素的作用，線粒體可以使青蒿素發揮更強的抗腫瘤作用，并且是青蒿素直接的，但不是唯一的靶點，ETC 與青蒿素的敏感性緊密相關。

4 結語

鐵、血紅素、線粒體都是細胞內不可分割的組成部分，后者更是包含了前者。許多實驗設計將三者的作用割裂開來，欲探索單一因素對青蒿素類化合物的激活機制，但都難以獲得全面的解釋（圖2）。血紅素已被證明是青蒿素重要的激活因素和靶蛋白，在不同生物體內都可在一定程度上激活青蒿素，因此被認為是介導青蒿素細胞毒活性的基礎[27,35]。研究還證實腫瘤細胞內是一個高鐵環境，游離的鐵來源于其細胞膜表面高表達的轉鐵蛋白，但腫瘤細胞線粒體中的鐵卻低于正常細胞，進一步降低了鐵對青蒿素激活的可能性[43]。Efferth 等[5]研究顯示，腫瘤細胞甚至同一組織來源的腫瘤細胞其轉鐵蛋白表達量都存在差異，且外源性的Fe2+不能激活所有細胞株中的青蒿素，僅可以提高某些腫瘤細胞中青蒿素的活性。后來的研究解釋，如果外源性鐵的加入沒有參與血紅素的合成，則不會增強青蒿素誘導腫瘤細胞凋亡的作用[27,36,44]。也有研究表明不能否認非血紅素鐵對青蒿素的激活作用，Stocks 等[45]的研究證明了這部分鐵可以穩定青蒿素與靶蛋白的加成物。外源性鐵的加入對青蒿素類化合物在不同腫瘤細胞中加成效果不同，而鐵螯合劑與青蒿素類化合物聯用時，卻能在大多數腫瘤細胞中逆轉青蒿素的抗腫瘤作用。因為鐵螯合劑不僅減少了游離鐵和血紅素中鐵的部分，還可抑制ETC 的活性，從多方面阻斷青蒿素的激活[34]。ETC 由復合物I～Ⅳ、電子載體泛醌組成，電子從復合物I或Ⅱ進入泛醌，經過 復合物Ⅲ和Ⅳ，轉移到分子氧而產生水，是細胞內ROS 產生的場所[46]。血紅素參與ETC 復合物Ⅱ～Ⅳ的組成，對電子傳遞、線粒體呼吸起著關鍵作用[32]。目前還沒有證實ETC 是青蒿素發揮抗腫瘤作用的激活因子，但已有文獻表明，功能性的ETC 一方面為青蒿素的激活提供還原動力，另一方面還可促進產生更多的ROS 以達到共同殺傷細胞的效果[35-36]。

圖2 青蒿素類化合物抗腫瘤作用的激活機制Fig.2 Activation mechanism of artemisinin and its derivatives in anti-tumor effects

青蒿素的抗腫瘤作用機制在學術界一直沒有統一的認識。普遍認為過氧橋基團是青蒿素的藥效基團，沒有過氧橋的化合物既不能與血紅素結合，也不能發揮較強的抑制腫瘤細胞生長的作用[23]。但也有研究顯示沒有過氧橋的新型青蒿素衍生物也有一定的抗腫瘤活性，青蒿素二聚體更好的抗腫瘤活性也不能僅通過2 個過氧橋來解釋[30,47]。在抗瘧疾的研究中發現，大部分青蒿素類化合物必須由某種因素激活才能產生氧自由基，進而重排為更具活性的碳自由基，發揮抗瘧作用[45]。大部分研究也證明青蒿素產生的ROS 是引起細胞死亡的主要原因，但是Lu 等[38]的研究表明雙氫青蒿素誘導HL-60 細胞線粒體損傷和細胞凋亡是通過激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路，而與ROS 無關，因為細胞內ROS 的含量沒有變化，并認為雙氫青蒿素在不同細胞內不一定都能產生ROS，可能與細胞的不同生物學背景有關[48]。

目前，針對青蒿素類化合物復雜的激活機制研究結果大多數來源于瘧原蟲或酵母模型，但是，腫瘤細胞是一個比瘧原蟲更復雜的生物學環境，單從線粒體及其功能來看，不同物種間就存在差異，這可能是很難對青蒿素的激活機制下定論的原因。由于青蒿素類化合物用于抗腫瘤方面的劑量大于抗瘧的劑量，因此發現安全的小分子化合物，以低劑量的形式高效地激活血紅素合成途徑或增敏青蒿素對線粒體的抑制作用，可能是今后的一個研究方向，旨在使青蒿素這個抗瘧藥發揮抗腫瘤作用切實可行。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突