人參屬植物高溫蒸制前后人參皂苷含量的變化和細胞毒活性研究

顧承真，曾碧雪，張鈺佳，王 東，張穎君*

1.福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350001

2.中國科學院昆明植物研究所，植物化學與西部植物資源可持續利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201

人參屬植物是最有價值的藥用植物，人參Panax ginsengMeyer、三七P.notoginseng(Burk.) F.H.Chen 和西洋參P.quinquefoliumL.都是人參屬植物中名貴的中藥材。在兩千多年前，人參屬植物的根就被用來治療和預防各種疾病[1]，其莖、葉、花和果實不但是重要的藥用資源，還被用作功能性食品和化妝品[2]。人參和三七主要產于亞洲，西洋參主要產于北美，近些年在中國東北也有種植。人參屬植物在高溫蒸制前后藥理活性不同，所以經常對其進行加工高溫蒸制后使用。傳統上人參根在使用的時候有白人參和紅人參2 種形式，白人參是收獲后直接晾干獲得，紅人參是經過加熱處理后形成的[3-5]。三七和西洋參的根經常經過浸泡或蒸煮后使用。中藥高溫蒸制已經有數千年的歷史，高溫蒸制不但能使藥材產生新的藥理或治療作用，還能夠減少或消除中藥的毒性或副作用。蒸煮、烘焙、焙炒、油炸、浸泡等都是常用的高溫蒸制方法。

近些年從人參屬植物不同部位分離得到的化合物有200 多個，包括人參皂苷、多糖、多肽和氨基酸等[6-8]。從高溫蒸制的根、莖、葉和花等部位也分離得到一些轉化的人參皂苷[2,9]。人參皂苷是人參屬植物中最典型的活性成分[2]，根據人參皂苷的結構可將其分為2 大類，原人參二醇型和原人參三醇型。對人參、三七、西洋參及其高溫蒸制品進行研究發現，不同人參屬植物中典型的人參皂苷也不同[10-12]。比如，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 和三七皂苷R1是三七根的主要成分，高溫蒸制后三七根的主要成分轉化為20(S/R)-人參皂苷Rg3、Rh1、Rk1、Rg5、Rk3和Rh4。不同人參屬植物由于化學成分不同導致其具有不同的藥理活性，比如抗癌、免疫調節、免疫抑制、抗過敏、抗動脈粥樣硬化、降血壓、預防糖尿病、抗病毒等[13-16]。目前，人參屬植物在高溫蒸制前后化學成分及其含量的變化缺少詳細的闡述。

本課題組從事人參屬植物研究已有二十多年，對其化學成分進行過系統的研究[9,16-22]。本實驗采用HPLC 法對人參、三七、西洋參及其高溫蒸制品、三七莖葉及其高溫蒸制品中的人參皂苷進行了定性和定量分析，并測定了人參屬植物及其高溫蒸制品對人類4 株癌細胞（人類骨髓癌HL-60 細胞、肝癌SMMC-7721 細胞、肺癌A-549 細胞、乳腺癌SK-BR-3細胞）的細胞毒活性。

1 材料與儀器

人參Panax ginsengMeyer 和西洋參Panax quinquefoliumL.的干燥根于2013年4月購買于中國吉林，三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen 整株樣品于2013年3月購買于云南文山，并且分為根和莖葉2 部分。這3 種樣品均由中國科學院昆明植物研究所張穎君研究員鑒定。

對照品人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd、Rk3、Rh4、Rk1、Rg5、Rb3、Rh3、Rk2，三七皂苷Fc 和R1，絞股藍皂苷IX，20(S/R)-三七皂苷Ft1，20(S/R)-三七皂苷Rg3、Rs3、Rh2，20(S)-人參皂苷Rh1，20(R)-人參皂苷Rh1為實驗室從人參屬植物中分離獲得并用質譜和核磁共振波譜鑒定其結構，HPLC 測定這些皂苷的質量分 數 均 大 于 95% 。 人 參 皂 苷 Rb2（ 批 號M21D11S135160）、Rc（批號M27GB141849）購買于上海同田生物技術有限公司，質量分數均＞98%。水用的是 Milli-Q 過濾水（Millipore S.A.S.67120 Molsheim-France facility），色譜級乙腈購買Merck 公司（Darmstadt，德國），其他溶劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 有效成分測定

2.1.1 供試品溶液的制備 人參、西洋參、三七根和三七莖葉噴灑適量水后放置于高壓滅菌鍋中，在120 ℃條件下蒸12 h，再保持24 h，得到高溫蒸制人參根、高溫蒸制西洋參根、高溫蒸制三七根和高溫蒸制三七莖葉。取上述高溫蒸制和未高溫蒸制的樣品各100 g 用70%甲醇水回流提取3 次，每次3 h。提取液濃縮除去有機溶劑，上D101 大孔吸附樹脂柱，用水洗脫，直到用薄層色譜板監控流出液無任何物質為止，用90%乙醇洗脫得到各個樣品的總皂苷，人參根總皂苷、高溫蒸制人參根總皂苷、西洋參根總皂苷、高溫蒸制西洋參根總皂苷、三七根總皂苷、高溫蒸制三七根總皂苷、三七莖葉總皂苷、高溫蒸制三七莖葉總皂苷。三七莖葉的70%提取物先用石油醚萃取后，再上D101 大孔吸附樹脂柱。取樣品各200 mg，樣品F 100 mg，加甲醇定容至10 mL，得到供試品溶液，然后用0.45 μm 膜濾過，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備 準確稱量22個對照品于5 mL量瓶中，用50%甲醇溶解、定容，得到各個質量濃度的對照品溶液，然后用0.45 μm膜濾過，得到含1.05 mg/mL人參皂苷Rg1、0.5 mg/mL人參皂苷Re、1.05 mg/mL 人參皂苷Rb1、0.9 mg/mL人參皂苷Rc、0.9 mg/mL人參皂苷Rb2、1.35 mg/mL人參皂苷Rd、0.55 mg/mL人參皂苷Rk3、0.9 mg/mL人參皂苷Rh4、1.0 mg/mL 20(S/R)-人參皂苷Rg3、1.75 mg/mL 20(S/R)-人參皂苷Rk1、0.6 mg/mL 20(S/R)-人參皂苷Rg5、0.524 mg/mL三七皂苷R1、0.95 mg/mL 20(S)-人參皂苷Rh1、1.0 mg/mL 20(R)-人參皂苷Rh1、5.25 mg/mL 三七皂苷Fc、0.95 mg/mL 人參皂苷Rb3、1.05 mg/mL絞股藍皂苷IX、1.0 mg/mL 20(S/R)-三七皂苷Ft1、2.3 mg/mL 20(S/R)-三七皂苷Rs3、1.0 mg/mL 20(S/R)-三七皂苷Rh2、0.375 mg/ mL 20(S/R)-三七皂苷Rh3、0.95 mg/mL 20(S/R)-三七皂苷Rk2的混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 高效液相色譜配備PAD 檢測器；色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm)；體積流量1.0 mL/min；進樣體積 10 μL；柱溫25 ℃；檢測波長203 nm；流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫：0～20 min，20%～22% A；20～45 min，22%～46% A；45～55 min，46%～55% A；55～75 min，55% A，75～90 min，55%～90% A。

2.1.4 線性關系考察 將每個對照品溶液按不同體積（2、5、10、20、40、80、100 μL）進高效液相色譜分析，然后以峰面積為縱坐標（Y）、進樣量為橫坐標（X）制成每個對照品的標準曲線及線性回歸方程，這22 個化合物的線性回歸方程見表1。

表1 化合物的線性方程Table 1 Linearity, correlation coefficient of compounds

2.1.5 精密度試驗 取照品混合液，連續進樣6 次，測定這22 種皂苷色譜峰的峰面積。人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd、Rk3、Rh4、Rk1、Rg5、Rb3、Rh3、Rk2，20(S)-人參皂苷Rh1、20(R)-人參皂苷Rh1、三七皂苷Fc、三七皂苷R1、絞股藍皂苷IX、20(S/R)-三七皂苷Ft1、20(S/R)-人參皂苷Rg3、人參皂苷Rs3、人參皂苷Rh2峰面積的RSD 值分別為0.86%、0.82%、0.57%、0.93%、0.54%、0.66%、0.96%、0.77%、0.69%、0.39%、0.89%、0.91%、1.02%、0.95%、1.04%、0.61%、0.52%、0.46%、0.77%、0.73%、0.69%、0.81%。

2.1.6 穩定性試驗 取人參樣品分別在配制好后1、4、8、16、32、48 h 進樣測定，計算人參樣品中6 個主要成分人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的RSD值分別為0.68%、0.99%、1.21%、1.32%、1.02%、0.98%。

2.1.7 重復性試驗 稱取人參樣品100 g，共6 份。按照供試品溶液制備方法，測定人參樣品中6 個主要成分的含量。人參中6 個主要成分人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的RSD 值分別為1.97%、1.99%、1.58%、1.87%、2.02%、2.13%。

2.1.8 加樣回收試驗 稱取人參樣品100 g，共6 份。分別加入與樣品中6 個主要成分含量相當的對照品溶液，按照供試品制備方法制備成加樣供試品溶液。測定6 個主要成分的含量，計算加樣回收率。人參中6個主要成分人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的加樣回收率分別為97.81%、98.79%、102.31%、101.36%、100.35%、103.12%，RSD 值分別為1.32%、1.15%、1.21%、1.01%、0.96%、1.19%。

2.1.9 人參皂苷含量測定 用“2.1.3”項色譜條件測定按照“2.1.1”項得到的樣品人參根總皂苷、高溫蒸制人參根總皂苷、西洋參根總皂苷、高溫蒸制西洋參根總皂苷、三七根總皂苷、高溫蒸制三七根總皂苷、三七莖葉總皂苷和高溫蒸制三七莖葉總皂苷中22 種皂苷的含量。每個樣品重復進樣3 次，取平均峰面積根據線性方程計算皂苷的含量。

2.2 人參皂苷含量測定結果

人參、西洋參、三七和三七莖葉及其高溫蒸制品的HPLC 譜圖見圖1，通過紫外吸收和保留時間跟對照品比對，共鑒定出22 個皂苷類化合物，人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd、Rk3、Rh4、Rk1、Rg5、Rb3、Rh3、Rk2、20(S)-人參皂苷Rh1、20(R)-人參皂苷Rh1、三七皂苷Fc、三七皂苷R1、絞股藍皂苷IX、20(S/R)-三七皂苷Ft1、20(S/R)-人參皂苷Rg3、Rs3和Rh2。這些化合物在人參、西洋參、三七和三七莖葉及其高溫蒸制品中的含量見表2。

圖1 人參屬植物及其高溫蒸制品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of samples from ginsengs and their steaming processed products

表2 人參屬植物及其高溫蒸制品中人參皂苷含量Table 2 Contents of saponins in eight ginseng samples

結果顯示，原人參二醇型和原人參三醇型人參皂苷是人參、三七和西洋參的主要成分，但在三七的莖葉中只檢測到原人參二醇型人參皂苷。人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2和Rd 為人參的主要成分；人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd 為西洋參的主要成分；人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd 和三七皂苷R1為三七的主要成分；三七皂苷Fc、人參皂苷Rb3和絞股藍皂苷IX 為三七莖葉的主要成分。人參皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd 是人參屬植物原材料中最常見的人參皂苷，但在不同的人參屬植物中，其含量也不同。人參皂苷Rg1和人參皂苷Rd 的含量，三七＞人參＞西洋參；人參皂苷Re 的含量，西洋參＞人參＞三七；人參皂苷Rb1的含量，西洋參＞三七＞人參。三七皂苷R1是三七特有的皂苷，在其他2 種人參屬植物中沒有檢測到。人參皂苷Rc 和Rb2是人參中特有的成分。三七皂苷Fc，人參皂苷Rb3和絞股藍皂苷IX 僅存在于三七莖葉中。

高溫蒸制后，人參、三七和西洋參的主成分全部轉化為人參皂苷Rk3、Rh4、Rk1、Rg5和20(S/R)-人參皂苷 Rg3。這5 個人參皂苷在高溫蒸制三七中的總含量比在高溫蒸制人參和高溫蒸制西洋參中的含量高。20(S)-人參皂苷Rh1和20(R)-人參皂苷 Rh1僅在高溫蒸制三七中檢測到，在其他高溫蒸制品中未檢出。三七莖葉中的三七皂苷Fc，人參皂苷Rb3和絞股藍皂苷 IX 經過高溫蒸制后轉化生成了20(S/R)-人參皂苷Rg3、人參皂苷Rk1、Rg5和20(S/R)-三七皂苷Ft1、人參皂苷Rs3、Rh2、Rh3和Rk2。

人參、西洋參、三七和三七莖葉主要皂苷在分子結構的C-3 位、C-6 位或者C-20 位連接2 個或者3 個不同類型的糖，高溫蒸制過程中先發生脫糖反應，然后在C-20/21 位或者C-20/22 位發生脫水反應后得到高溫蒸制人參、西洋參、三七和三七莖葉的主要皂苷成分。

2.3 細胞毒活性

測定人參、西洋參、三七和三七莖葉及其高溫蒸制品對4 株人類癌細胞（HL-60、SMMC-7721、A-549、SK-BR-3）的細胞毒活性。采用MTT 法［ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenlytetrezolium bromide］（Sigma 公司，St.Louis，美國），通過96孔板測定上述8 個樣品的細胞毒活性[23]。所有細胞都用DMEM 培養基（Hyclone，美國），添加10%胎牛血清，5% CO2、37 ℃條件下培養。將100 μL 的懸浮液添加到96 孔板中，再在96 孔板中加入不同濃度的供試品溶液，培養48 h 后，在每孔中添加20 μL MTT溶液（5 mg/mL PBS），繼續培養4 h得到formazan晶體。除去上清液后加入100 μL 20%的十二烷基磺酸鈉（SDS），培養過夜直到formazan 晶體完全溶解。用酶標儀在595 nm 條件下測定吸光度，半數抑制濃度（IC50）值計算采用Reed 和Muench 方法。

細胞毒測定結果顯示，人參、高溫蒸制人參、西洋參、高溫蒸制西洋參、三七和三七莖葉在100 μg/mL 的質量濃度下對4 株人類癌細胞（圖2）顯示出微弱的抑制活性。高溫蒸制三七莖葉和高溫蒸制三七對A-549 和HL-60 顯示出很強的抑制活性，IC50分別為43.3、33.8 μg/mL（A549），21.6、40.0 μg/mL（HL-60），陽性對照順鉑的IC50為6.7 μg/mL（A549）和0.4 μg/mL（HL-60）。高溫蒸制三七的細胞毒活性比高溫蒸制人參、高溫蒸制西洋參和三七強，說明高溫蒸制后三七的細胞毒活性增強。高溫蒸制三七具有較強的細胞毒活性與其化學成分息息相關，20(S)-人參皂苷Rh1和20(R)-人參皂苷Rh1只存在于高溫蒸制三七中，并且20(S/R)-人參皂苷Rg3在高溫蒸制三七中的含量比在其他樣品中的含量高。前期有研究報道人參皂苷Rg3和Rh1具有一定的細胞毒活性，導致高溫蒸制三七細胞毒活性比其他樣品強[24-25]。

圖2 人參屬植物及其高溫蒸制品的細胞毒活性Fig.2 Cytotoxic activities of samples from ginsengs and their processed products

3 討論

對人參、西洋參、三七和三七莖葉及其高溫蒸制品中的人參皂苷進行了定性和定量分析。經過高溫蒸制原材料中的主要成分完全消失，轉化為另外5 個主成分[人參皂苷Rk3、Rh4、Rk1、Rg5和20(S/R)-人參皂苷Rg3]。三七的細胞毒活性比人參和西洋參強，高溫蒸制三七的細胞毒活性又強于三七，說明高溫蒸制后三七的細胞毒活性增強，這也符合中藥高溫蒸制的目的。研究結果為人參、西洋參和三七的研究和應用提供了基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突